Towards systems metabolic engineering in Pichia pastoris
- 作者
- Jan-Philipp Schwarzhans, Tobias Luttermann, Martina Geier, Jörn Kalinowski, Karl Friehs
- 单位
- Fermentation Engineering, Bielefeld University, Universitätsstr. 25, Bielefeld 33615, Germany; Microbial Genomics and Biotechnology, Center for Biotechnology (CeBiTec), Bielefeld University, Universitätsstr. 27, Bielefeld 33615, Germany; Austrian Center of Industrial Biotechnology (acib), Petersgasse 14, Graz 8010, Austria
- 杂志
- Biotechnology Advances（2017）
- DOI
- 10.1016/j.biotechadv.2017.07.009
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
毕赤酵母虽已成为重要的重组蛋白生产宿主，但克隆变异性、载体库有限、基因组注释不足等问题阻碍其发展为系统代谢工程平台。本文旨在总结最新进展，推动在毕赤酵母中建立系统代谢工程。
研究策略
综述性研究：系统总结毕赤酵母在组学技术、遗传工程、启动子工程、基因组规模代谢模型、过氧化物酶体区室化等方面的最新进展，并分析机遇与挑战。
核心内容
毕赤酵母已被广泛用于重组蛋白生产，但其克隆变异性高、遗传工具匮乏等问题限制了其向系统代谢工程平台的发展。该综述系统总结了近年来在毕赤酵母中建立系统代谢工程的最新进展，涵盖组学技术、启动子工程、CRISPR/Cas9基因编辑、基因组规模代谢模型以及过氧化物酶体区室化等策略。在启动子工程方面，通过敲除MIG1、MIG2、NRG1并过表达MIT1获得的MF1菌株，其pAOX1驱动的GFP表达在甘油培养时达到野生型的77%，初步实现了无甲醇诱导的表达系统。通过敲除KU70消除非同源末端连接，靶向整合效率显著提升，但细胞生长速率下降约20%。此外，将番茄红素合成途径靶向至过氧化物酶体，产量比胞质定位提高4倍，证明区室化策略可有效提升代谢产物合成效率。这些进展表明，毕赤酵母已初步具备系统代谢工程所需的技术基础，有望发展为生产重组蛋白和多种价值代谢物的完整微生物细胞工厂。
创新点
无甲醇依赖的pAOX1表达系统（通过敲除MIG1/MIG2/NRG1并过表达MIT1实现）、新型启动子与终止子的发现、CRISPR/Cas9基因编辑的建立、过氧化物酶体区室化合成代谢产物、基于全基因组测序解析克隆变异机制等。
研究对象（10）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Pichia pastoris (Komagataella phaffii) | 甲醇利用通路 (MUT) | AOX1 | 醇氧化酶 1 (Alcohol oxidase 1) | 催化 | 受甲醇诱导强启动子 pAOX1 调控，是毕赤酵母最常用的外源蛋白表达系统 |
| Pichia pastoris (Komagataella phaffii) | 甲醇利用通路 (MUT) | MXR1 | Mxr1 (甲醇表达调节因子 1) | 调控 | 转录激活因子，在去阻遏时结合 pAOX1 |
| Pichia pastoris (Komagataella phaffii) | 甲醇利用通路 (MUT) | MIT1 | Mit1 (甲醇诱导转录因子 1) | 调控 | 调节 MUT 通路基因表达，需 prm1 激活 |
| Pichia pastoris (Komagataella phaffii) | 甲醇利用通路 (MUT) | PRM1 | Prm1 (甲醇正调控因子 1) | 调控 | 组成型表达，诱导 mit1 表达 |
| Pichia pastoris (Komagataella phaffii) | 甲醇利用通路 (MUT) | NRG1 | Nrg1 | 调控 | 葡萄糖抑制基因的负调控因子，直接结合 pAOX1 位点 |
| Pichia pastoris (Komagataella phaffii) | 甲醇利用通路 (MUT) | MIG1, MIG2 | Mig1, Mig2 | 调控 | 多拷贝抑制因子，与 NRG1 共同抑制 pAOX1 |
| Pichia pastoris (Komagataella phaffii) | 糖酵解 | GAP | 甘油醛-3-磷酸脱氢酶 (GAPDH) | 催化 | 构成型启动子 pGAP 的对应基因 |
| Pichia pastoris (Komagataella phaffii) | 过氧化物酶体生物发生 | PEX30, PEX31 | Pex30p, Pex31p | 区室化 | 控制油酸诱导的过氧化物酶体数量和大小 |
| Pichia pastoris (Komagataella phaffii) | 过氧化物酶体靶向 | — | PTS1 信号序列 | 区室化 | 过氧化物酶体靶向序列 1，用于将重组蛋白定位到过氧化物酶体 |
| Pichia pastoris (Komagataella phaffii) | 非同源末端连接 (NHEJ) | KU70 | Ku70 | 调控 | NHEJ 通路关键蛋白，其缺失可消除随机整合，但生长率约降低 20% |
关键发现
['毕赤酵母已生产超过5000种重组蛋白，并获FDA GRAS地位。', '克隆变异性可导致同一转化事件中产物浓度相差高达30倍（破伤风毒素片段C）。', "多拷贝克隆频率约5-10%，'jackpot'菌株（GCN>10）频率约1%。", '敲除KU70消除NHEJ通路后，靶向整合效率显著提高，但细胞生长速率降低约20%。', '通过全基因组测序发现8%的克隆因AOX1终止子介导的二级整合而成为假阳性。', '工程菌株MF1（ΔMIG1/ΔMIG2/ΔNRG1 + 过表达MIT1）中，pAOX1驱动的GFP表达在甘油培养时达野生型的77%，甲醇培养时达130%。', 'pAOX1天然表达量极高，AOX1蛋白可占总蛋白的约30%。', '过氧化物酶体靶向的番茄红素合成途径产量比胞质定位提高4倍。', '在酿酒酵母中，过氧化物酶体区室化使脂肪酸衍生燃料/化学品的产量提高4倍以上。']
研究结论
近年来毕赤酵母在基因组注释、遗传工具、启动子工程和代谢模型等方面取得显著进展，已具备系统代谢工程的基础。通过结合过氧化物酶体区室化等策略，毕赤酵母有望成为生产重组蛋白和多种价值代谢物的完整微生物细胞工厂。