Identification and functional analysis of brassiccene C biosynthetic gene cluster in Alternaria brassicicola
- 作者
- Atsushi Minami, Naoto Tajima, Yusuke Higuchi, Tomonobu Toyomasu, Takeshi Sassa, Nobuo Kato, Tohru Dairi
- 单位
- Biotechnology Research Center, Toyama Prefectural University; The Institute of Scientific and Industrial Research, Osaka University; Department of Bioresource Engineering, Yamagata University
- 杂志
- Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters（2008）
- DOI
- 10.1016/j.bmcl.2008.11.108
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
从基因组数据库中鉴定芸苔菌素C（brassicicene C）的生物合成基因簇，并解析关键酶的催化功能，为利用基因工程改造二萜类化合物的产生提供基础。
研究策略
以具有GGDP合酶结构域和二萜环化酶结构域的PaFS为探针，搜索基因数据库，在Alternaria brassicicola ATCC 96836中发现同源基因簇；通过体内表达和体外酶学实验验证orf8和orf6的功能。
核心内容
该研究以具有GGDP合酶和二萜环化酶结构域的PaFS为探针，在模式链格孢菌Alternaria brassicicola ATCC 96836的基因组中鉴定出brassicicene C的生物合成基因簇，该基因簇涵盖orf1至orf11，预测包含5个P450基因、一个短链脱氢酶/还原酶、一个乙酰基转移酶、一个甲基转移酶、一个双加氧酶及一个未知功能基因。通过在大肠杆菌M15中异源表达orf8，GC-MS检测到与标准品fusicoccadiene一致的产物峰，证实其编码双功能fusicoccadiene合酶，该蛋白含697个氨基酸，与PaFS同源性为47%；表达orf6的细胞裂解液可将FC H aglycon转化为C-16位甲基化产物，表明其编码甲基转移酶。从13.2升培养液中提取纯化获得2.9 mg brassicicene C，分子式为C21H32O4。该工作首次完整解析了brassicicene C的生物合成基因簇并明确关键酶功能，为利用基因工程与化学酶促法合成此类二萜化合物提供了重要的酶学基础和操作靶点。
创新点
首次鉴定出芸苔菌素C的生物合成基因簇；证明orf8编码双功能fusicoccadiene合酶，orf6编码催化C-16位羟基甲基化的甲基转移酶。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Alternaria brassicicola ATCC 96836 | brassicicene C生物合成 | orf8 | Orf8 | 催化 | 双功能fusicoccadiene合酶，含GGDP合酶结构域和二萜环化酶结构域，催化fusicoccadiene生成 |
| Escherichia coli M15 | 二萜生物合成 | orf8 | Orf8 | 催化 | 异源表达验证orf8功能，产物经GC-MS确认为fusicoccadiene |
| Escherichia coli M15 | 二萜生物合成 | orf6 | Orf6 | 催化 | 甲基转移酶，以S-腺苷-L-甲硫氨酸为甲基供体催化C-16羟基甲基化 |
关键发现
- 从13.2 L培养液中提取并纯化得到2.9 mg brassicicene C，分子式C21H32O4
- Orf8编码697个氨基酸，与PaFS有47%同源性
- 在E. coli M15中表达orf8后，GC-MS检测到与标准品fusicoccadiene一致的峰
- 表达orf6的细胞裂解液可将FC H aglycon转化为16-甲基化产物，而对照无此产物
- 基因簇包含orf1-orf11，推测有5个P450基因、1个短链脱氢酶/还原酶、1个乙酰基转移酶、1个甲基转移酶、1个双加氧酶和1个未知功能基因。
研究结论
成功鉴定了A. brassicicola ATCC 96836中brassicicene C的生物合成基因簇，并明确了Orf8和Orf6的功能，分别为fusicoccadiene合酶和甲基转移酶，为后续通过基因工程和化学酶促法合成此类二萜化合物奠定了基础。