Alkylating enzymes
- 作者
- Ludger A Wessjohann, Jeanette Keim, Benjamin Weigel and Martin Dippe
- 单位
- Leibniz- Institute of Plant Biochemistry, Department of Bioorganic Chemistry, Weinberg 3, D-06120 Halle, Germany
- 杂志
- Current Opinion in Chemical Biology（2013）
- DOI
- 10.1016/j.cbpa.2013.02.016
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
天然产物中甲基、异戊烯基和C-糖苷等烷基化修饰的化学合成具有化学选择性差、区域选择性不理想、步骤繁多等问题，缺乏高效绿色的方法。
研究策略
综述酶辅助的烷基化策略，重点介绍异戊烯基转移酶（含萜烯合酶/环化酶）和甲基转移酶在体外酶催化、全细胞生物转化及代谢工程中的应用，并讨论辅因子再生和组合生物合成。
核心内容
该文系统综述了烷基化酶在天然产物生物合成中的应用进展。由于化学烷基化存在选择性差、步骤繁琐等缺陷，研究者转向开发酶辅助策略，重点聚焦异戊烯基转移酶和甲基转移酶，涵盖体外催化、全细胞转化与代谢工程等模式。文中展示了多个代表性案例：工程酵母通过甲羟戊酸途径强化，使amorpha-4,11-二烯产量达到40 g/l，而artemisinic acid为0.1 g/l；α-pinene合酶催化GDP生成α-pinene，经氧化获得产率150 mg/l、对映体过量>98%的(+)-verbenone；CdpC3PT催化的反向C3-异戊烯基化转化率达85–100%；水稻OMT-9与大豆OMT-2串联可近乎定量地将山柰酚转化为ermanin。这些结果说明，烷基化酶的底物谱和区域选择性已能支撑复杂结构的精准修饰，通过组合生物合成还能创造非天然产物。不过，异戊烯基二磷酸和SAM辅因子的规模化供应与再生仍是制约工业应用的关键瓶颈，未来需继续发掘底物谱更宽且选择性严格的酶。
创新点
系统总结了具有宽底物谱但严格区域选择性的新型烷基化酶（如DMATS家族、CdpNMT、SirD、Fnq26等）的应用；展示了通过代谢工程在酵母中实现amorpha-4,11-二烯高达40 g/l的产量；提出通过组合生物合成创造新型非天然产物结构。
研究对象（19）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 体外酶催化 | 单萜生物合成 | α-pinene synthase | α-pinene synthase | 催化 | 转化GDP生成α-pinene，后经化学氧化生成(+)-verbenone，产率150 mg/l，ee>98% |
| Saccharomyces cerevisiae | 甲羟戊酸途径/倍半萜生物合成 | epi-cedrol synthase（来自Artemisia annua） | Epi-cedrol synthase | 催化 | 异源表达实现epi-cedrol的胞内合成 |
| Saccharomyces cerevisiae | 甲羟戊酸途径/倍半萜生物合成 | amorpha-4,11-diene synthase (ADS) | Amorpha-4,11-diene synthase | 催化 | 生产amorpha-4,11-二烯，产量高达40 g/l |
| Saccharomyces cerevisiae | 甲羟戊酸途径/青蒿素前体生物合成 | artemisinic acid生物合成相关基因（如CYP71AV1等） | 细胞色素P450等 | 催化 | 生产artemisinic acid，产量0.1 g/l |
| Salvia sclarea | 二萜生物合成 | 两个二萜环化酶基因 | 二萜环化酶 | 催化 | 两步酶法从GGDP合成sclareol |
| Aspergillus fumigatus | 吲哚生物碱异戊烯基化 | FgaPT2 (4-DMATS) | 4-dimethylallyltyptophan synthase | 催化 | 选择性异戊烯基化吲哚环C4位 |
| Aspergillus fumigatus | 吲哚生物碱异戊烯基化 | 7-DMATS | 7-dimethylallyltyptophan synthase | 催化 | 选择性异戊烯基化吲哚环C7位，与FgaPT2串联可生成4,7-双异戊烯基产物 |
| Aspergillus fumigatus | 环二肽异戊烯基化 | CdpNMT | CdpNMT | 催化 | 催化2,5-二酮哌嗪的N1-异戊烯基化，并显示对酚类的C-异戊烯基化活性 |
| Leptosphaeria maculans | 酪氨酸衍生物异戊烯基化 | SirD | SirD | 催化 | 混杂催化O-, N-, C-异戊烯基化，包括酪氨酸对位及色氨酸吲哚C7位 |
| Neosartorya fisheri | 吡咯并[2,3-b]吲哚生物碱异戊烯基化 | CdpC3PT | CdpC3PT | 催化 | 催化反向β-C3-异戊烯基化，生成aszonalenin衍生物，转化率85-100% |
| Escherichia coli | 芳香族异戊烯基转移 | ubiA | UbiA | 催化 | 广谱GDP依赖型异戊烯基转移酶，用于合成Kuhistanol A |
| Escherichia coli | 香兰素生物合成 | catechol-O-methyltransferase | Catechol-O-methyltransferase | 催化 | 重组表达用于从葡萄糖发酵生产香兰素 |
| 水稻/大豆 | 类黄酮甲基化 | ROMT-9 (水稻OMT-9), OMT-2 (大豆OMT-2) | O-甲基转移酶9/2 | 催化 | 串联催化山柰酚转化为ermanin，接近定量转化 |
| Populus deltoides | 类黄酮甲基化 | OMT-7（工程化变体） | O-甲基转移酶7 | 催化 | 工程化后催化山柰酚和槲皮素生成3,7-二-O-甲基产物，产率58%和70% |
| Escherichia coli | 类黄酮生物合成 | 来自Streptomyces avermitilis和薄荷的7-O-甲基转移酶 | 7-O-甲基转移酶 | 催化 | 从对香豆酸合成7-O-甲基山柰酚（2.7 mg/l）和genkwanin（0.2 mg/l） |
| Escherichia coli | 二苯乙烯类生物合成 | 重建植物途径相关基因（含OMT） | O-甲基转移酶 | 催化 | 从苯丙氨酸、酪氨酸等合成单/二甲基化二苯乙烯，产量最高37 mg/l（60 h） |
| Hyoscyamus niger | 托品烷生物碱生物合成 | putrescine N-methyltransferase (PMT) | 腐胺N-甲基转移酶 | 催化 | 转基因毛状根过表达PMT，提高东莨菪碱产量 |
| Catharanthus roseus | 硫醇甲基化 | SMT | S-甲基转移酶 | 催化 | 对脂肪族和芳香族硫醇具有混杂活性 |
| Streptomyces等放线菌 | 抗生素生物合成（C-甲基化/C-糖基化） | CMT基因 / C-糖基转移酶基因 | C-甲基转移酶 / C-糖基转移酶 | 催化 | 异源表达或失活以产生糖基修饰的新型抗生素 |
关键发现
- α-pinene合酶转化GDP生成α-pinene，经氧化得到(+)-verbenone，产率150 mg/l，ee>98%
- 工程酵母中amorpha-4,11-二烯产量达40 g/l，artemisinic acid产量为0.1 g/l
- CdpC3PT催化吡咯并[2,3-b]吲哚衍生物的反向C3-异戊烯基化，转化率85-100%
- 工程化OMT-7催化山柰酚和槲皮素生成3,7-二-O-甲基产物，产率分别为58%和70%
- 重组大肠杆菌从对香豆酸合成7-O-甲基山柰酚2.7 mg/l和genkwanin 0.2 mg/l
- 二苯乙烯类甲基化产物最高产量37 mg/l（60小时）
- 橙皮素经双酶转化合成3-O-甲基山柰酚产率50%
- 水稻OMT-9与大豆OMT-2串联催化山柰酚转化为ermanin，接近定量转化。
研究结论
烷基化酶已从最初被认为过于特异和难以应用于生物合成，转变为合成复杂天然产物的重要工具。未来需要发现底物谱广且区域选择性严格的酶，并解决异戊烯基二磷酸与辅因子SAM的规模化供应和再生问题，以推动工业应用。