Recent advances in synthetic biology for engineering isoprenoid production in yeast
- 作者
- Claudia E Vickers, Thomas C Williams, Bingyin Peng, Joel Cherry
- 单位
- Australian Institute for Bioengineering and Nanotechnology, The University of Queensland; Commonwealth Research Organization (CSIRO), Land and Water, Ecosciences Precinct; Department of Chemistry and Biomolecular Sciences, Macquarie University; Amyris, Emeryville, CA, USA
- 杂志
- Current Opinion in Chemical Biology（2017）
- DOI
- 10.1016/j.cbpa.2017.05.017
- 所属领域
- 代谢工程 / 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
在酵母中高效合成异戊二烯类化合物，解决工业应用中的产率、滴度和速率不足问题，特别是前体供给和代谢通量分配。
研究策略
综述了合成生物学工具在酵母异戊二烯生产中的应用，包括：工程中心碳代谢增加乙酰辅酶A供给；在法尼基二磷酸节点控制竞争通量；将FPP合酶改造成GPP或GGPP合酶以生产C10或C20异戊二烯；细胞色素P450介导的复杂二萜合成；以及蛋白支架、动态调控、SCRaMbLE等新兴策略。
核心内容
该综述系统总结了合成生物学工具在酵母异戊二烯类化合物生产中的应用进展，聚焦于前体供给与代谢通量分配两大瓶颈。在策略上，作者梳理了从工程中心碳代谢以增加乙酰辅酶A供给，到在法尼基二磷酸节点控制竞争通量，再到改造FPP合酶底物特异性以生产C10或C20异戊二烯的多层次干预手段，并涉及细胞色素P450介导的复杂二萜合成以及蛋白支架、动态调控和SCRaMbLE等新兴工具。关键结果方面，表达沙门氏菌乙酰辅酶A合酶L641P使amorphadiene滴度增加1.2倍；过表达泛酸激酶CAB1联合PDH旁路使naringenin产量提高24倍；通过重写中心碳代谢实现法尼烯产量达15% v/v，碳利用率提高20%，氧利用率提高280%；将ERG20改造成GPP合酶使sabinene产量提高340倍；通过ERG9反馈调控使amorphadiene产量增加2至5倍。这些数据表明，酵母是异戊二烯工业化生产的优秀底盘，未来需结合系统生物学、自动化高通量筛选和合成基因组学实现设计-构建-部署范式，以进一步提高产量并拓宽产品范围。
创新点
利用磷酸酮醇酶/转乙酰酶途径提高碳利用率；通过蛋白质工程改造FPP合酶底物特异性；利用蛋白降解标签动态控制鲨烯合酶；利用dCas9转录调控和RNA干扰；应用SCRaMbLE技术进行基因组规模进化。
研究对象（23）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae | 甲羟戊酸(MVA)途径 | ERG10 | 乙酰乙酰辅酶A硫解酶 | 催化 | 催化两分子乙酰辅酶A缩合生成乙酰乙酰辅酶A，异戊二烯生物合成的第一步 |
| Saccharomyces cerevisiae | 甲羟戊酸(MVA)途径 | ERG13 | HMG-CoA合酶 | 催化 | 催化乙酰乙酰辅酶A与乙酰辅酶A缩合生成HMG-CoA |
| Saccharomyces cerevisiae | 甲羟戊酸(MVA)途径 | tHMG1 | 截短HMG-CoA还原酶 | 催化 | MVA途径限速酶，截短型用于解除反馈抑制 |
| Saccharomyces cerevisiae | 甲羟戊酸(MVA)途径 | ERG12 | 甲羟戊酸激酶 | 催化 | 催化甲羟戊酸磷酸化 |
| Saccharomyces cerevisiae | 甲羟戊酸(MVA)途径 | ERG8 | 磷酸甲羟戊酸激酶 | 催化 | 催化磷酸甲羟戊酸进一步磷酸化 |
| Saccharomyces cerevisiae | 甲羟戊酸(MVA)途径 | MVD1 | 二磷酸甲羟戊酸脱羧酶 | 催化 | 催化二磷酸甲羟戊酸脱羧生成IPP |
| Saccharomyces cerevisiae | 甲羟戊酸(MVA)途径 | IDI1 | 异戊烯基二磷酸异构酶 | 催化 | 催化IPP与DMAPP相互转化 |
| Saccharomyces cerevisiae | 异戊二烯前体合成 | ERG20 | 法尼基二磷酸合酶 | 催化 | 天然合成FPP，经蛋白质工程改造为GPP或GGPP合酶，用于C10/C20异戊二烯生产 |
| Saccharomyces cerevisiae | 甾醇合成 | ERG9 | 鲨烯合酶 | 催化 | 催化两分子FPP缩合生成鲨烯，与目标C15产物竞争；常通过启动子工程或蛋白降解标签进行动态调控 |
| Saccharomyces cerevisiae | 二萜前体合成 | BTS1 | 香叶基香叶基二磷酸合酶 | 催化 | 催化FPP与IPP缩合生成GGPP，C20异戊二烯前体 |
| Saccharomyces cerevisiae | 乙酰辅酶A合成（PDH旁路） | ALD6 | 乙醛脱氢酶 | 催化 | 催化乙醛氧化为乙酸，用于提高乙酰辅酶A供给 |
| Saccharomyces cerevisiae | 乙酰辅酶A合成 | ACS1/ACS2 | 乙酰辅酶A合酶 | 催化 | 催化乙酸生成乙酰辅酶A，消耗ATP |
| Saccharomyces cerevisiae | 乙醇代谢 | ADH2 | 醇脱氢酶 | 催化 | 催化乙醇氧化为乙醛，用于增加乙酰辅酶A前体 |
| Saccharomyces cerevisiae | 中心碳代谢（非氧化糖酵解） | xPK | 木酮糖-5-磷酸磷酸酮醇酶 | 催化 | 来自异源菌，与PTA联合将X5P转化为乙酰辅酶A，减少碳损失 |
| Saccharomyces cerevisiae | 中心碳代谢（非氧化糖酵解） | PTA | 磷酸转乙酰酶 | 催化 | 将磷酸乙酰基转移至辅酶A生成乙酰辅酶A |
| Saccharomyces cerevisiae | 乙酰辅酶A合成（ATP非依赖） | ADA | 酰化乙醛脱氢酶 | 催化 | 来自细菌，将乙醛直接转化为乙酰辅酶A，不消耗ATP |
| Saccharomyces cerevisiae | 乙酰辅酶A合成（ATP非依赖） | PFL | 丙酮酸甲酸裂解酶 | 催化 | 将丙酮酸转化为乙酰辅酶A和甲酸，不消耗ATP |
| Saccharomyces cerevisiae | 乙酰辅酶A合成（ATP非依赖） | PDHC | 丙酮酸脱氢酶复合体 | 催化 | 细菌来源复合体在胞质表达，实现ATP非依赖的乙酰辅酶A合成 |
| Saccharomyces cerevisiae | 三羧酸循环/乙酰辅酶A合成 | ACL | ATP柠檬酸裂解酶 | 催化 | 裂解柠檬酸生成乙酰辅酶A和草酰乙酸 |
| Saccharomyces cerevisiae | 二萜氧化修饰 | ATR1 | 细胞色素P450还原酶 | 调控 | 来自拟南芥，为异源细胞色素P450提供电子，是氧化修饰途径的功能伴侣 |
| Saccharomyces cerevisiae | 异戊二烯合成调控 | GAL1 | 半乳糖激酶启动子调控系统 | 调控 | 工程化半乳糖诱导调控网络用于动态控制MVA途径基因表达 |
| Saccharomyces cerevisiae | 异戊二烯合成调控 | dCas9 | 无核酸酶活性的Cas9 | 调控 | 靶向MVA途径基因启动子实现转录激活或抑制 |
| Saccharomyces cerevisiae | 异戊二烯合成调控 | Rnt1p | RNase III家族蛋白 | 调控 | 靶向ERG9 mRNA的3'UTR发夹结构实现mRNA不稳定化，降低鲨烯合酶表达 |
关键发现
- 表达沙门氏菌乙酰辅酶A合酶L641P使amorphadiene滴度增加1.2倍
- 过表达泛酸激酶CAB1联合PDH旁路使naringenin产量提高24倍
- Meadows等通过重写中心碳代谢实现法尼烯产量达15% v/v，碳利用率提高20%，氧利用率提高280%
- Ignea等将ERG20改造成GPP合酶使sabinene产量提高340倍
- 通过ERG9反馈调控使amorphadiene产量增加2-5倍
- 理论计算表明法尼烯最佳产率需要44%和56%的乙酰辅酶A分别来自磷酸酮醇酶途径和ATP非依赖性丙酮酸途径。
研究结论
酵母是异戊二烯工业生产的优秀底盘，未来需结合系统生物学、自动化高通量筛选和合成基因组学（如SCRaMbLE）实现设计-构建-部署（DBD）范式，以提高产量并拓宽产品范围。