Aza-Tryptamine Substrates in Monoterpene Indole Alkaloid Biosynthesis
- 作者
- Hyang-Yeol Lee, Nancy Yerkes, Sarah E. O'Connor
- 单位
- Massachusetts Institute of Technology, Department of Chemistry, 77 Massachusetts Avenue, Cambridge, MA 02139, USA
- 杂志
- Chemistry & Biology（2009）
- DOI
- 10.1016/j.chembiol.2009.11.016
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
如何利用非天然的氮杂吲哚（aza-indole）取代色胺中的吲哚环，将其作为起始底物引入单萜吲哚生物碱生物合成途径，从而合成新型氮杂生物碱。
研究策略
化学合成四种氮杂色胺异构体（4-、5-、6-、7-氮杂色胺），评价其作为长春花（Catharanthus roseus）单萜吲哚生物碱途径中异胡豆苷合成酶（strictosidine synthase）催化Pictet-Spengler反应的底物能力；将能被酶利用的底物（4-和7-氮杂色胺）与裂环马钱子苷（secologanin）孵育生成氮杂异胡豆苷，脱糖后喂入C. roseus细胞培养物，经LC-MS和NMR鉴定新产生的氮杂生物碱。
核心内容
本研究以非天然氮杂色胺为起始底物，探索单萜吲哚生物碱途径的底物混杂性，以期合成新型氮杂生物碱。作者化学合成了4-、5-、6-、7-四种氮杂色胺异构体，并评价其作为长春花异胡豆苷合成酶催化底物的能力。酶动力学显示4-和7-氮杂色胺可被有效转化，而5-和6-异构体无活性；7-氮杂色胺的kcat为11.8 min⁻¹、KM为65 μM，催化效率较天然底物色胺低约100倍。将酶产物脱糖后喂入长春花细胞培养物，经LC-MS和NMR鉴定，成功分离出7-氮杂异西特西日碱等新型氮杂育亨宾型生物碱。该工作首次证明氮杂吲哚功能基团可作为前体定向生物合成的起始底物，通过劫持植物天然产物途径产生非天然化合物，为利用色胺衍生途径发酵生产氮杂生物碱奠定了基础。
创新点
首次证明氮杂吲哚功能基团可作为前体定向生物合成的起始底物，成功将4-和7-氮杂色胺掺入单萜吲哚生物碱途径，产生氮杂异胡豆苷型生物碱（如7-氮杂异西特西日碱）。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | 异源表达 | — | strictosidine synthase (异胡豆苷合成酶) | 催化 | 用于体外酶活测定和动力学分析（表达并纯化自E. coli） |
| Catharanthus roseus | monoterpene indole alkaloid biosynthesis (单萜吲哚生物碱生物合成) | — | strictosidine synthase (异胡豆苷合成酶) | 催化 | 催化aza-tryptamine与secologanin的Pictet-Spengler反应，生成氮杂异胡豆苷类似物 |
| Catharanthus roseus | monoterpene indole alkaloid biosynthesis | — | strictosidine glucosidase (异胡豆苷葡萄糖苷酶) | 催化 | 催化strictosidine及aza-strictosidine的脱糖反应，产生下游中间体 |
关键发现
- 4-和7-氮杂色胺（1和4）可被异胡豆苷合成酶转化为相应的氮杂四氢-β-咔啉产物（7和10），而5-和6-氮杂色胺（2和3）无产物生成。7-氮杂色胺的动力学参数为kcat=11.8±0.4 min⁻¹、KM=65±9.1 μM，较色胺（kcat=96±4.7 min⁻¹、KM=5±1.4 μM）催化效率约低100倍
- 4-氮杂色胺的kcat=10.2±0.3 min⁻¹、KM=151±9.3 μM，较色胺低约280倍。C2位化学位移：7-氮杂色胺115.9 ppm、5-氮杂色胺131.0 ppm、4-氮杂色胺135.2 ppm、6-氮杂色胺137.5 ppm，但电子密度与酶反应活性不一致。将脱糖的氮杂异胡豆苷（7和10）喂入C. roseus细胞培养物后，经LC-MS观察到m/z 354和m/z 356的新化合物
- 从7-氮杂色胺来源的产物中分离纯化了7-氮杂异西特西日碱（14），其NMR数据与(3α,16R,19E)-isositsirikine一致。
研究结论
研究表明，通过向产生生物体中引入非天然起始底物（氮杂色胺），可以劫持生物合成途径产生新化合物。4-和7-氮杂色胺成功被整合到长春花的单萜吲哚生物碱途径中，产生氮杂杂育亨宾型生物碱。这是首个在微生物和植物天然产物途径中利用非天然氮杂环进行前体定向生物合成的报道，为从其他色氨酸/色胺衍生途径发酵生产氮杂生物碱奠定了基础。