Biosynthesis and Activity of Prenylated FMN Cofactors

作者: Po-Hsiang Wang, Anna N. Khusnutdinova, Fei Luo, Johnny Xiao, Kayla Nemr, Robert Flick, Greg Brown, Radhakrishnan Mahadevan, Elizabeth A. Edwards, Alexander F. Yakunin
单位: Department of Chemical Engineering and Applied Chemistry, University of Toronto; Department of Cell and Systems Biology, University of Toronto
杂志: Cell Chemical Biology（2018）
DOI: 10.1016/j.chembiol.2018.02.007
所属领域: 合成生物学
关键词: DMAP生物合成UbiD脱羧酶UbiX家族异戊二烯化FMN辅因子辅因子表征
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解决的核心问题

解析异戊二烯化FMN（prFMN）辅因子在E. coli中的生物合成来源（特别是DMAP的产生途径）、游离prFMN的生化特性及其对UbiD家族脱羧酶的激活机制。

研究策略

结合系统发育分析、异源表达纯化、基于AF1214的报告系统筛选E. coli激酶与Nudix水解酶，优化prFMN合成条件并提取游离辅因子，通过酶活测定和质谱表征不同prFMN形式，最终在体外验证游离prFMN对Fdc1的激活作用。

研究路线图

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核心内容

该研究系统解析了大肠杆菌中异戊二烯化FMN（prFMN）辅因子的生物合成来源及对UbiD家族脱羧酶的激活机制。通过系统发育分析发现UbiX家族包含超过9000个序列并分为5个主要簇，从14个可溶性UbiX样蛋白中纯化出5个携带prFMN自由基的紫色蛋白。研究首次阐明大肠杆菌中二甲基烯丙基磷酸（DMAP）由两条途径生成：ThiM激酶磷酸化prenol，以及NudF/NudJ水解酶去磷酸化DMAPP。在此基础上开发了高效生产游离prFMN的方法，鉴定出质子化prFMN自由基等新形式，并确定其消光系数为6.3 mM⁻¹cm⁻¹。体外实验证明游离prFMN可在有无二硫苏糖醇还原条件下激活Fdc1脱羧酶，表观Km为9–19 μM，还原后酶活提升2–3倍，正磷酸盐可进一步刺激激活。该工作将类异戊二烯代谢与泛醌生物合成联系起来，为理解prFMN辅因子的多样性和应用奠定了基础。

创新点

（1）证明UbiX家族所有主要谱系均具有FMN异戊二烯化活性；（2）首次阐明E. coli中DMAP由ThiM磷酸化prenol和NudF/NudJ去磷酸化DMAPP两条途径生成；（3）开发了高效生产游离prFMN的方法并鉴定两种新的prFMN形式（质子化prFMN自由基C和C1',C2'-二羟基化prFMN H）；（4）发现游离prFMN可在有无DT还原的条件下激活Fdc1，并确定其高亲和力。

研究对象（7）

底盘细胞	代谢通路	基因	蛋白	功能	说明
E. coli BL21(DE3)	prFMN生物合成	PA4019	PA4019 (UbiX)	催化	来自铜绿假单胞菌的FMN异戊二烯转移酶，催化DMAP的异戊二烯基转移到FMN，生成prFMN。
E. coli BL21(DE3)	prFMN生物合成	AF1214	AF1214 (UbiX)	催化	来自Archaeoglobus fulgidus的UbiX同源蛋白，对FMN亲和力较高，作为DMAP检测的报告蛋白。
E. coli BL21(DE3)	硫胺素生物合成/异戊二烯代谢	thiM	ThiM	催化	羟乙基噻唑激酶，催化prenol磷酸化生成DMAP，对prenol的Km为14 mM。
E. coli BL21(DE3)	类异戊二烯途径	nudF	NudF	催化	ADP-核糖焦磷酸酶（Nudix家族），催化DMAPP去磷酸化生成DMAP。
E. coli BL21(DE3)	类异戊二烯途径	nudJ	NudJ	催化	Nudix水解酶，催化DMAPP去磷酸化生成DMAP，其Vmax约为NudF的2倍。
E. coli BL21(DE3)	苯丙烷类降解/芳香酸脱羧	fdc1	Fdc1	催化	来自黑曲霉的阿魏酸脱羧酶，属于UbiD家族，需prFMN辅因子催化α,β-不饱和酸的可逆脱羧。
E. coli BL21(DE3)	泛醌生物合成	ubiD	UbiD	催化	E. coli UbiD，需prFMN的脱羧酶，本文以Fdc1为模型研究其激活。

关键发现

系统发育分析显示UbiX家族包含超过9000个序列，分为5个主要簇
成功纯化了14个可溶性UbiX-like蛋白，其中5个（AF1214、MJ0101、SMb20135、MTH0147、PA4019）呈紫色并携带prFMN自由基
AF1214对DMAP的表观Km为30 μM
E. coli ThiM激酶磷酸化prenol和THZ的速率分别为0.18和0.19 μmol/min/mg，Km分别为14 mM和2.0 mM
NudF和NudJ对DMAPP的Km分别为0.8 mM和0.5 mM，Vmax分别为0.15和0.3 μmol/min/mg
游离prFMN自由基的m/z为524.165，质子化prFMN自由基的m/z为526.182，消光系数为6.3 mM^-1 cm^-1 (490 nm)
Fdc1在无DT还原条件下活性为1-2.5 U/mg，经DT还原后活性提高2-3倍
游离prFMN激活Fdc1的表观Km为9-19 μM
正磷酸盐刺激Fdc1激活（表观Km 6.7±1.1 mM）。

研究结论

本研究揭示了prFMN辅因子在E. coli中的生物合成路径，将类异戊二烯代谢与泛醌生物合成联系在一起；同时建立了游离prFMN的制备与表征方法，证明UbiD家族脱羧酶可被游离prFMN高效激活，为理解该新型辅因子的多样性和应用奠定了基础。