RAF Inhibitors, Fishing Bacterial Transporters Out of Metagenomes, and Yeast-Based, Industrial Scale Production of Isoprenoids
- 作者
- Milka Kostic
- 杂志
- Cell Chemical Biology（2016）
- DOI
- 10.1016/j.chembiol.2016.10.005
- 所属领域
- 化学生物学
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
总结近期三项化学生物学进展：RAF抑制剂的作用机制、从宏基因组中鉴定细菌转运蛋白的新方法、以及酵母工业化生产异戊二烯类化合物的代谢工程优化。
研究策略
分别介绍三项研究：通过结构生物学和生化分析揭示RAF抑制剂异位调节机制；利用核糖开关生物传感器结合工程大肠杆菌从宏基因组DNA文库中筛选转运蛋白；通过添加异源酶和代谢通路建模改造酿酒酵母中心代谢以最大化碳和氧的利用，提高β-法尼烯产量。
核心内容
该论文综述了化学生物学领域三项代表性进展。在RAF抑制剂研究中，通过结构生物学与生化分析，揭示了αC-螺旋的构象位置决定抑制剂特异性：αC-IN型可稳定螺旋并抑制RAF二聚体，而αC-OUT型仅抑制单体且易诱导耐药，鉴于B-RAFV600E突变存在于超过50%的黑色素瘤中，这一机制为RAF靶向药物的设计提供了关键结构基础。在宏基因组转运蛋白挖掘方面，研究者利用ThiM19 TPP响应核糖开关作为生物传感器，在含0.5 μM硫胺素的条件下筛选大肠杆菌宏基因组文库，成功鉴定出PnuT类新型硫胺素转运蛋白，建立了从宏基因组中发现功能膜蛋白的高通量筛选平台。在酵母代谢工程中，通过向酿酒酵母引入木酮糖-5-磷酸特异性磷酸酮醇酶（xPK）、乙醛脱氢酶（ADA）、NADH消耗型HMG-CoA还原酶及磷酸转乙酰酶（PTA）四种异源酶，结合代谢通路建模优化碳与氧的利用，在200,000升工业生物反应器中实现了β-法尼烯的高产稳定生产。三项工作分别展示了化学生物学在药物机制解析、功能基因挖掘和工业规模生物制造中的转化潜力。
创新点
揭示αC-螺旋位置决定RAF抑制剂对二聚体或单体的抑制特异性；开发基于核糖开关的高通量筛选方法，发现新PnuT类细菌硫胺素转运蛋白；在工业规模（200,000 L）下实现β-法尼烯的高产生产。
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 人类细胞 | RAS-RAF-MEK-ERK信号通路 | BRAF | B-RAF | 调控 | RAF激酶家族成员，B-RAFV600E突变与黑色素瘤相关 |
| 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) | 甲羟戊酸/异戊二烯合成途径 | — | xPK (木酮糖-5-磷酸特异性磷酸酮醇酶) | 催化 | 来自Leuconostoc mesenteroides，增加乙酰辅酶A供应 |
| 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) | 甲羟戊酸/异戊二烯合成途径 | — | ADA (乙醛脱氢酶) | 催化 | 来自Dickeya zeae，调节乙酰辅酶A和NADH平衡 |
| 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) | 甲羟戊酸/异戊二烯合成途径 | — | NADH-HMG (NADH消耗的HMG-CoA还原酶) | 催化 | 来自Silicibacter pomeroi，消耗NADH并催化HMG-CoA还原 |
| 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) | 甲羟戊酸/异戊二烯合成途径 | — | PTA (磷酸转乙酰酶) | 催化 | 来自Clostridium kluyveri，参与乙酰辅酶A生成 |
| 大肠杆菌 (Escherichia coli) | 硫胺素代谢/转运 | pnuC | PnuC | 转运 | 烟酰胺核糖苷/单核苷酸转运蛋白，在此筛选中作为潜在硫胺素摄取转运蛋白 |
| 大肠杆菌 (Escherichia coli) | 硫胺素代谢/转运 | — | PnuT | 转运 | 新发现的细菌硫胺素转运蛋白类，通过核糖开关筛选鉴定 |
| 大肠杆菌 (Escherichia coli) | 核糖开关调控 | thiM19 | ThiM19核糖开关 | 调控 | TPP响应核糖开关，用于筛选宏基因组文库中的转运蛋白 |
关键发现
- B-RAFV600E突变存在于超过50%的黑色素瘤中
- αC-IN型RAF抑制剂可稳定αC螺旋并抑制RAF二聚体，而αC-OUT型抑制剂仅抑制单体，且会诱导耐药
- 利用ThiM19 TPP响应核糖开关，在含0.5 μM硫胺素条件下筛选宏基因组文库，发现PnuT一类新的硫胺素转运蛋白
- 通过向酿酒酵母引入xPK、ADA、NADH-HMG和PTA四种酶，使200,000 L工业生物反应器稳定生产β-法尼烯。
研究结论
三项研究分别提供了RAF靶向药物的结构基础、从宏基因组发现功能转运蛋白的有效平台，以及酵母代谢工程实现大规模异戊二烯生产的可行路径，展示了化学生物学和合成生物学的转化潜力。