Simultaneous determination of intracellular nucleotides and coenzymes in Yarrowia lipolytica producing lipid and lycopene by capillary zone electrophoresis
- 作者
- Chen Zhao, Yan Yang, Linfang Wei, Qinghua Guo, Hao Fang, Shaolin Chen, Qiang Hua
- 单位
- College of Life Sciences, Northwest A&F University; Biomass Energy Center for Arid and Semi-arid Lands, Northwest A&F University; State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, East China University of Science and Technology
- 杂志
- Journal of Chromatography A（2017）
- DOI
- 10.1016/j.chroma.2017.07.074
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
缺乏在解脂耶氏酵母中同时分析胞内核苷酸和辅酶的方法，限制了对产脂和产番茄红素代谢机制的理解。
研究策略
利用毛细管区带电泳（CZE）技术，系统优化缓冲液浓度、pH和样品提取方法，建立分析方法，并应用于比较产番茄红素菌株与对照菌株的代谢物差异，结合多元统计分析。
核心内容
该研究针对解脂耶氏酵母中胞内核苷酸与辅酶缺乏同步分析方法的瓶颈，建立了基于毛细管区带电泳（CZE）的检测体系。通过系统优化缓冲液浓度、pH及样品提取条件，最终采用70 mM碳酸盐缓冲液（含1% β-CD，pH 10）、15 kV分离电压，在32分钟内成功分离12种代谢物（包括4种辅酶、5种核苷酸和3种核苷）。沸水提取法展现出最佳回收效果，回收率达97.1%~101.9%，标准曲线线性良好（R²>0.995）。应用该方法比较产番茄红素菌株与对照菌株的代谢差异，发现第6天番茄红素产量为5.37 mg/L，脂质含量在两种菌株中分别为26.83%和22.48%。主成分分析揭示ATP和NADP+水平与番茄红素积累密切相关，提示二者可能是关键代谢节点。该研究为解脂耶氏酵母的代谢机制解析提供了可靠的分析工具，并指出ATP和NADP+作为潜在代谢工程改造靶点，有助于推动产番茄红素及脂质的发酵优化。
创新点
建立了在解脂耶氏酵母中同时测定12种核苷酸/辅酶/核苷的CZE方法；优化了提取方法（沸水法优于冷甲醇和沸乙醇法）；发现ATP和NADP+可能是番茄红素积累的关键代谢物。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Yarrowia lipolytica | 脂质合成/积累 | — | — | 调控 | 脂质积累代谢分析 |
| Yarrowia lipolytica | 番茄红素合成 | crtE, crtB, crtI | — | 催化 | 异源表达番茄红素合成基因 |
关键发现
- 优化后的CZE方法可在32 min内分离12种代谢物（4种辅酶、5种核苷酸、3种核苷），使用70 mM碳酸盐缓冲液（含1% β-CD，pH 10），电压15 kV
- 沸水提取法回收率97.1%~101.9%
- 标准曲线R²>0.995（NADPH为0.963）
- 在产番茄红素菌株中，第6天番茄红素产量达5.37 mg/L，脂质含量YLP为26.83%、YLEBI为22.48%
- PCA分析显示ATP和NADP+与番茄红素积累密切相关。
研究结论
建立的CZE方法可有效用于解脂耶氏酵母中核苷酸和辅酶的同时测定；ATP和NADP+可能参与番茄红素积累，为代谢工程改造和发酵优化提供了分析工具和潜在靶点。