Metabolic engineering of microbial pathways for advanced biofuels production
- 作者
- Fuzhong Zhang, Sarah Rodriguez, Jay D Keasling
- 单位
- Department of Chemical Engineering, University of California, Berkeley; Department of Molecular and Cellular Biology, University of California, Berkeley; Joint BioEnergy Institute; Synthetic Biology Engineering Research Center; Physical Bioscience Division, Lawrence Berkeley National Laboratory
- 杂志
- Current Opinion in Biotechnology（2011）
- DOI
- 10.1016/j.copbio.2011.04.024
- 所属领域
- 代谢工程 / 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
利用可再生的纤维素生物质生产先进生物燃料以替代石油基燃料，解决第一代生物燃料（如乙醇）在能量密度、吸水性、与食物竞争等方面的局限。
研究策略
以大肠杆菌和酿酒酵母为底盘，通过合成生物学和代谢工程手段引入异源代谢途径，从中心代谢物（磷酸烯醇式丙酮酸、丙酮酸、乙酰辅酶A）出发合成多种先进生物燃料；通过优化前体供应、引入不可逆酶促反应、平衡还原力、下调竞争途径等策略提高产量。
核心内容
该研究系统综述了利用代谢工程和合成生物学手段，以大肠杆菌和酿酒酵母为底盘细胞生产先进生物燃料的策略与进展。研究者通过引入异源代谢途径，从磷酸烯醇式丙酮酸、丙酮酸和乙酰辅酶A等中心代谢物出发，合成醇类、萜类、脂肪酸衍生物及烷烃等多种燃料分子。所采用的关键策略包括利用天然高流量氨基酸途径产生2-酮酸前体、引入不可逆酶（如Ter）驱动丁醇途径通量、通过蛋白质工程（如LeuA突变体）拓展底物范围合成C6-C8醇、异源表达蓝藻烷烃合成基因（AAR/ADC）、以及组合优化萜类和脂肪酸途径（如下调erg9、靶向蛋白质组学）。代表性结果为异丙醇最高产量达143 g/L（理论产率67%），丁醇最高产量30 g/L（理论产率70-88%）。这些进展表明，通过整合高流量前体利用、不可逆酶驱动和辅因子平衡等策略，代谢工程已显著提升微生物燃料的产率与产量，使大肠杆菌和酿酒酵母成为生产多种先进生物燃料的通用平台。
创新点
综述总结了多项创新：利用天然高流量氨基酸途径产生2-酮酸前体合成醇类；采用不可逆酶（如Ter）驱动丁醇途径通量；通过蛋白质工程（LeuA突变体）拓展底物范围合成C6-C8醇；发现并异源表达蓝藻烷烃生物合成基因（AAR/ADC）；实现从纤维素生物质到生物燃料的整合生物加工（如Xyn10B和Xsa共表达）；对萜类和脂肪酸途径进行组合优化（如靶向蛋白质组学、下调erg9等）。
研究对象（30）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | 异丙醇生物合成 | thl/phaA | Thl/PhaA | 催化 | 乙酰辅酶A乙酰转移酶，催化两分子乙酰-CoA缩合为乙酰乙酰-CoA |
| Escherichia coli | 异丙醇生物合成 | atoAD/ctfAB | AtoAD/CtfAB | 催化 | 辅酶A转移酶，将乙酰乙酰-CoA转化为乙酰乙酸 |
| Escherichia coli | 异丙醇生物合成 | adc | Adc | 催化 | 乙酰乙酸脱羧酶，将乙酰乙酸脱羧为丙酮 |
| Escherichia coli | 异丙醇生物合成 | adh | Adh | 催化 | 醇脱氢酶（来自Clostridium beijerinckii），将丙酮还原为异丙醇 |
| Escherichia coli | 丁醇生物合成 | hbd | Hbd | 催化 | 3-羟基丁酰-CoA脱氢酶，催化乙酰乙酰-CoA还原为3-羟基丁酰-CoA |
| Escherichia coli | 丁醇生物合成 | crt | Crt | 催化 | 巴豆酸酶，催化3-羟基丁酰-CoA脱水为巴豆酰-CoA |
| Escherichia coli | 丁醇生物合成 | ter | Ter | 催化 | 丁酰-CoA脱氢酶（来自Treponema denticola），不可逆地将巴豆酰-CoA还原为丁酰-CoA |
| Escherichia coli | 丁醇生物合成 | adhE2 | AdhE2 | 催化 | 醛/醇脱氢酶，将丁酰-CoA还原为丁醛并进一步还原为丁醇 |
| Escherichia coli | 丁醇生物合成 | fdh | Fdh | 能量供给 | 甲酸脱氢酶，催化甲酸氧化生成CO2和NADH，为丁醇合成提供还原力 |
| Escherichia coli | 丁醇生物合成 | aceEF-lpd | 丙酮酸脱氢酶复合物 | 能量供给 | 过表达丙酮酸脱氢酶复合物，同时提供乙酰-CoA和NADH，促进丁醇合成 |
| Escherichia coli | 2-酮酸途径（高级醇合成） | kivd | KDC | 催化 | 2-酮酸脱羧酶（来自Lactococcus lactis），将2-酮酸脱羧为醛 |
| Escherichia coli | 2-酮酸途径（高级醇合成） | adh2 | Adh2 | 催化 | 醇脱氢酶（来自Saccharomyces cerevisiae），将醛还原为醇 |
| Escherichia coli | 2-酮酸途径（高级醇合成） | alsS | AlsS | 催化 | 乙酰乳酸合酶，催化丙酮酸生成乙酰乳酸，增强2-酮异戊酸前体合成 |
| Escherichia coli | 2-酮酸途径（高级醇合成） | ilvCD | IlvCD | 催化 | 二羟酸脱水酶/还原异构酶，促进缬氨酸和异亮氨酸途径中2-酮酸合成 |
| Escherichia coli | 2-酮酸途径（高级醇合成） | leuA (mutant) | LeuA | 催化 | 2-异丙基苹果酸合酶突变体，扩大底物结合口袋以合成C6-C8中等链长醇 |
| Escherichia coli | 甲羟戊酸途径（萜类合成） | ispA | FPP合酶 | 催化 | 法尼基焦磷酸合酶，催化IPP/DMAP缩合生成FPP，增强法尼醇前体供应 |
| Escherichia coli | 甲羟戊酸途径（萜类合成） | nudB | NudB | 催化 | 焦磷酸水解酶（来自Bacillus subtilis），水解IPP/DMAP生成异戊烯醇 |
| Saccharomyces cerevisiae | 甲羟戊酸途径（萜类合成） | erg9 | Erg9 | 催化 | 角鲨烯合酶，催化FPP生成角鲨烯；下调其表达可减少FPP分流，提高法尼醇产量 |
| Escherichia coli | 脂肪酸衍生物生物合成 | tesA | TesA | 催化 | 截短的内源酰基-ACP硫酯酶，水解酰基-ACP释放游离脂肪酸 |
| Escherichia coli | 脂肪酸衍生物生物合成 | fadD | FadD | 催化 | 酰基-CoA合成酶，激活游离脂肪酸为酰基-CoA，用于下游酯化或还原 |
| Escherichia coli | 脂肪酸衍生物生物合成 | atfA | AtfA | 催化 | 蜡酯合酶，催化酰基-CoA与乙醇酯化生成脂肪酰乙酯 |
| Escherichia coli | 脂肪酸衍生物生物合成 | pdc | Pdc | 催化 | 丙酮酸脱羧酶，将丙酮酸转化为乙醛（来自Zymomonas mobilis） |
| Escherichia coli | 脂肪酸衍生物生物合成 | adhB | AdhB | 催化 | 醇脱氢酶，将乙醛还原为乙醇，用于FAEE合成 |
| Escherichia coli | 脂肪酸衍生物生物合成 | acr1 | Acr1 | 催化 | 酰基-CoA还原酶（来自Acinetobacter calcoaceticus），将酰基-CoA还原为脂肪醇 |
| Escherichia coli | 脂肪酸衍生物生物合成 | acc | ACC | 催化 | 乙酰-CoA羧化酶，将乙酰-CoA转化为丙二酰-CoA，提供脂肪酸延伸的底物 |
| Escherichia coli | 烷烃生物合成 | aar | AAR | 催化 | 酰基-ACP还原酶（来自蓝藻），将酰基-ACP还原为脂肪醛 |
| Escherichia coli | 烷烃生物合成 | adc | ADC | 催化 | 醛脱羧酶（来自蓝藻），将脂肪醛脱羧为烷烃（C13-C17） |
| Escherichia coli | 烯烃生物合成 | oleTJE | OleTJE | 催化 | 细胞色素P450脂肪酸脱羧酶（来自Jeotgalicoccus spp.），催化游离脂肪酸脱羧生成末端烯烃 |
| Escherichia coli | 纤维素降解（整合生物加工） | xyn10B | Xyn10B | 催化 | 内切木聚糖酶催化域（来自Clostridium stercorarium），水解木聚糖为木糖 |
| Escherichia coli | 纤维素降解（整合生物加工） | xsa | Xsa | 催化 | 木聚糖酶（来自Bacteroides ovatus），水解木聚糖为可发酵糖 |
关键发现
- 异丙醇最高产量143 g/L（理论产率67%，240 h）
- 丁醇最高产量30 g/L（理论产率70-88%）
- 异丁醇产量22 g/L（理论产率86%）
- 法尼醇产量135 mg/L（E. coli）
- FAEE产量427 mg/L（理论产率9.4%）
- 脂肪醇产量0.06 g/L（理论产率0.7%）
- 烷烃产量300 mg/L（理论产率3.5%）
- 脂肪酸产量可达4.5 g/L/day（理论产率20%）
- 倍半萜amorpha-4,11-diene产量>500 mg/L，taxadiene产量1 g/L，levopimaradiene产量700 mg/L。
研究结论
通过代谢工程和合成生物学，大肠杆菌和酿酒酵母已被成功改造为生产多种先进生物燃料（醇类、萜类、脂肪酸衍生物、烷烃和烯烃）的平台。尽管尚无单一宿主或燃料能完全替代其他，但利用高流量天然前体、不可逆酶、平衡辅因子等策略显著提高了产率和产量。未来需进一步整合组学数据，快速迭代优化菌株，以实现经济可行的微生物燃料生产。