Pathway engineering for functional isoprenoids
- 作者
- Norihiko Misawa
- 单位
- Research Institute for Bioresources and Biotechnology, Ishikawa Prefectural University
- 杂志
- Current Opinion in Biotechnology（2011）
- DOI
- 10.1016/j.copbio.2011.01.002
- 所属领域
- 代谢工程 / 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
功能异戊二烯（单萜、倍半萜、二萜、三萜及类胡萝卜素）在微生物和植物宿主中高效生产，以及相关生物合成基因与酶的鉴定。
研究策略
以大肠杆菌、酿酒酵母和高等植物为宿主，通过表达异源生物合成基因，优化MEP或甲羟戊酸途径，克服限速步骤，利用底物杂泛性P450和叶绿体转化等策略提升产量。
核心内容
该研究系统综述了通过代谢途径工程在微生物和植物宿主中生产功能异戊二烯类化合物的进展。研究者以大肠杆菌、酿酒酵母及高等植物为主要底盘，通过表达异源生物合成基因并优化内源MEP或甲羟戊酸途径，克服限速步骤以提升目标产物产量。关键策略包括过表达途径瓶颈酶、利用底物杂泛性P450变体进行区域选择性氧化，以及通过叶绿体转化实现植物内高效合成。结果显示，工程大肠杆菌可实现青蒿素前体amorphadiene高达27.4 g/L的产量，MEP途径优化后taxadiene产量达1 g/L；酿酒酵母中青蒿酸产量为250 mg/L。在植物宿主中，转基因穗薰衣草叶片柠檬烯含量提升超过450%，烟草叶绿体虾青素积累达5.44 mg/g干重。这些结果证明，通过多层次的途径工程策略，微生物和植物底盘均能高效合成高价值异戊二烯类化合物，为青蒿素和紫杉醇等药物的半合成生产奠定了可行基础。
创新点
在大肠杆菌中实现青蒿素前体amorphadiene的27.4 g/L高产；通过MEP途径瓶颈基因过表达使taxadiene产量达1 g/L；利用P450 BM3变体实现区域和立体选择性环氧化；通过叶绿体转化使烟草叶片虾青素积累达5.44 mg/g干重。
研究对象（14）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | 单萜生物合成 | GPP synthase gene from Abies grandis | Geranyl diphosphate synthase | 催化 | 产生GPP前体，与柠檬烯合酶共表达生产柠檬烯约5 mg/L |
| Escherichia coli | 单萜生物合成 | (-)-limonene synthase gene from Mentha spicata | (-)-Limonene synthase | 催化 | 催化GPP环化生成柠檬烯 |
| Lavandula latifolia (spike lavender) | 单萜生物合成 | Limonene synthase gene from Mentha spicata | Limonene synthase | 催化 | 组成型表达，叶片柠檬烯含量增加超过450% |
| Saccharomyces cerevisiae | 甲羟戊酸途径 / 单萜生物合成 | (S)-linalool synthase gene from Clarkia breweri; endogenous HMG-CoA reductase catalytic domain gene | Linalool synthase; HMG-CoA reductase | 催化 | 重组酵母分泌芳樟醇超过人类感知阈值，过表达HMG-CoA还原酶催化域使产量翻倍 |
| Escherichia coli | 倍半萜生物合成（青蒿素前体） | Amorphadiene synthase (ADS) gene from Artemisia annua; mevalonate pathway genes (including HMG-CoA synthase and reductase from Staphylococcus aureus) | Amorphadiene synthase | 催化 | 通过补料分批发酵优化氮供给，amorphadiene产量达27.4 g/L |
| Saccharomyces cerevisiae | 甲羟戊酸途径 / 倍半萜修饰 | ADS, CYP71AV1, and NADPH-cytochrome P450 reductase (CPR) genes from Artemisia annua | CYP71AV1 (amorphadiene oxidase) | 催化 | 摇瓶培养生产artemisinic acid 250 mg/L |
| Escherichia coli | 倍半萜修饰 | P450 BM3 variant (F87A/R47L/Y51F/A328L) gene from Bacillus megaterium | Cytochrome P450 BM3 variant | 催化 | 选择性环氧化amorphadiene生成artemisinic-11S,12-epoxide，产量250 mg/L（48小时培养） |
| Escherichia coli | 倍半萜修饰（zerumbone前体） | CYP71BA1 gene from Zingiber zerumbet; Arabidopsis thaliana ATR2 gene; heterologous D-mevalonate utilizing genes | Cytochrome P450 CYP71BA1 | 催化 | 转化α-humulene生成8-hydroxy-α-humulene，产量3.0 mg/L（补加D-mevalonolactone） |
| Saccharomyces cerevisiae | 二萜生物合成（紫杉醇前体） | Taxadiene synthase from Taxus chinensis; truncated HMG-CoA reductase; GGPP synthase from Sulfolobus acidocaldarius | Taxadiene synthase; GGPP synthase | 催化 | taxadiene产量8.7 mg/L |
| Escherichia coli | MEP途径 / 二萜生物合成 | dxs, ispD, ispF, idi; taxadiene synthase; GGPP synthase | MEP pathway enzymes, taxadiene synthase, GGPP synthase | 催化 | 过表达MEP瓶颈酶，补料分批发酵taxadiene产量达1 g/L |
| Escherichia coli | 二萜修饰（紫杉醇前体） | Taxadiene 5α-hydroxylase gene fused with Taxus CPR (transmembrane region removed) | Taxadiene 5α-hydroxylase (cytochrome P450) | 催化 | 生产taxadien-5α-ol，最高产量58 mg/L |
| Escherichia coli | 三萜生物合成（角鲨烯） | Squalene/phytoene synthase and FPP synthase genes from Streptomyces peucetius; endogenous dxs and idi genes | Squalene synthase, FPP synthase | 催化 | 角鲨烯产量11.8 mg/L |
| Escherichia coli | 类胡萝卜素生物合成（番茄红素） | GGPP synthase gene and carotenoid biosynthesis gene clusters | Carotenoid biosynthesis enzymes | 催化 | 通过多维度基因靶点和基因敲除优化，24小时批次培养中番茄红素接近20 mg/g细胞 |
| Nicotiana tabacum (tobacco) | 类胡萝卜素生物合成（虾青素） | crtZ (β-carotene hydroxylase) and crtW (β-carotene ketolase) genes | CrtZ, CrtW | 催化 | 叶绿体转化，虾青素积累达5.44 mg/g干重，占总类胡萝卜素70%以上 |
关键发现
- 工程大肠杆菌生产柠檬烯约5 mg/L；转基因穗薰衣草叶片柠檬烯含量提高超过450%；过表达HMG-CoA还原酶催化域使芳樟醇产量翻倍；大肠杆菌生产amorphadiene达27.4 g/L；重组酵母生产青蒿酸250 mg/L；大肠杆菌通过P450 BM3变体生产amorphadiene环氧化物250 mg/L；大肠杆菌生产8-羟基-α-蛇麻烯3.0 mg/L；酿酒酵母生产taxadiene
- 7 mg/L；大肠杆菌生产taxadiene 1 g/L，taxadien-5α-ol 58 mg/L；大肠杆菌生产abietadiene 100 mg/L和levopimaradiene 700 mg/L；酿酒酵母生产geranylgeraniol 134 mg/L；大肠杆菌生产squalene
- 8 mg/L；番茄果实积累α-zingiberene最高1.0 μg/g鲜重；烟草叶绿体积累astaxanthin
- 44 mg/g干重（占总类胡萝卜素70%以上）；大肠杆菌中lycopene产量接近20 mg/g细胞。
研究结论
途径工程已成功在大肠杆菌和酿酒酵母中生产出青蒿素和紫杉醇的半合成前体，并在烟草叶绿体中高效合成了虾青素，展示了微生物和植物底盘在功能性异戊二烯生产中的巨大潜力。