Recent progress in the metabolic engineering of alkaloids in plant systems
- 作者
- Weslee S Glenn, Weerawat Runguphan, Sarah E O'Connor
- 单位
- John Innes Centre, Department of Biological Chemistry; Massachusetts Institute of Technology; University of East Anglia, School of Chemistry
- 杂志
- Current Opinion in Biotechnology（2013）
- DOI
- 10.1016/j.copbio.2012.08.003
- 所属领域
- 代谢工程 / 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
植物生物碱的生物合成、调控和转运机制知之甚少，限制了通过代谢工程提高这些药用化合物产量及创造新结构类似物的能力。
研究策略
综述了近年来通过酶发现（如共表达分析）、酶工程（如底物特异性改造、结构导向设计）、基因簇挖掘、异源宿主重构（酵母、大肠杆菌、烟草等）以及多基因堆叠和通路调谐等手段，对单萜吲哚生物碱、苄基异喹啉生物碱和芥子油苷进行代谢工程改造的研究进展。
研究路线图
核心内容
该文综述了植物生物碱代谢工程近年来的进展。针对单萜吲哚生物碱、苄基异喹啉生物碱和芥子油苷三类化合物，研究者综合运用共表达分析发现新酶、酶工程改造底物特异性、挖掘生物碱途径基因簇以及在酵母、大肠杆菌和烟草等异源宿主中重构通路等策略，解决了部分生物合成与调控机制不清的瓶颈。关键结果包括：在长春花中过表达转录因子CrWRKY1使蛇根碱产量增加3倍、阿吗碱增加10倍；过表达反馈不敏感的邻氨基苯甲酸合酶使它波宁提高4.5倍；在酵母中重构苄基异喹啉生物碱途径可产生S-网状番荔枝碱最高达150 mg/L；共表达γ-谷氨酰肽酶使苄基硫代葡萄糖苷产量提高5.7倍，共表达腺苷5-磷酸硫酸激酶则提高16倍；酵母中重构吲哚基硫代葡萄糖苷途径滴度达1.07 mg/mL。这些工作表明，尽管面临代谢平衡和区室化等挑战，通过多基因堆叠、通路调谐和异源表达，已能在多种宿主中显著提高植物生物碱产量，为工业化生产奠定了基础。
创新点
强调de novo组合生物合成（如卤化酶引入植物代谢）、利用共表达分析发现新型P450和非血红素铁(II)双加氧酶、首次发现生物碱途径基因簇、通过共表达硫代谢酶解除瓶颈、利用scaffolding和可调启动子控制代谢流等创新策略。
研究对象（14）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Catharanthus roseus | monoterpene indole alkaloid (MIA) biosynthesis | TDC | tryptophan decarboxylase | 催化 | 催化色氨酸脱羧为色胺，为MIA提供吲哚前体 |
| Catharanthus roseus | monoterpene indole alkaloid (MIA) biosynthesis | STS | strictosidine synthase | 催化 | 催化色胺与断马钱子苷缩合形成严格斯啶 |
| Catharanthus roseus | monoterpene indole alkaloid (MIA) biosynthesis | CYP71B1 | cytochrome P450 monooxygenase | 催化 | 催化tabersonine或luchericine的19位羟化 |
| Catharanthus roseus | monoterpene indole alkaloid (MIA) biosynthesis | RebH | tryptophan halogenase | 催化 | 引入氯原子至色氨酸，实现卤化MIA的de novo合成 |
| Catharanthus roseus | monoterpene indole alkaloid (MIA) biosynthesis | CrWRKY1 | WRKY transcription factor | 调控 | 正调控MIA生物合成，过表达使蛇根碱和阿吗碱产量增加 |
| Papaver somniferum | morphinan alkaloid biosynthesis | CODM | codeine O-demethylase | 催化 | 催化可待因和蒂巴因的3位去甲基化 |
| Papaver somniferum | morphinan alkaloid biosynthesis | T6ODM | thebaine 6-O-demethylase | 催化 | 催化蒂巴因和俄巴因的6位去甲基化 |
| Papaver somniferum | morphinan alkaloid biosynthesis | COR | codeinone reductase | 催化 | 催化可待因酮还原为可待因，是吗啡生物合成的倒数第二步 |
| Eschscholzia californica | benzylisoquinoline alkaloid (BIA) biosynthesis | BBE | berberine bridge enzyme | 催化 | 催化(S)-网状番荔枝碱形成小檗碱桥 |
| Saccharomyces cerevisiae | benzylisoquinoline alkaloid (BIA) biosynthesis | NCS, 6-OMT, CNMT, 4'-OMT, DRS, DRR等 | norcoclaurine synthase等 | 催化 | 异源重构BIA途径，可产生S-reticuline及下游生物碱 |
| Nicotiana benthamiana | benzylglucosinolate biosynthesis | γ-glutamyl peptidase | gamma-glutamyl peptidase | 催化 | 共表达该酶解除瓶颈，使苯甲葡糖苷产量提高5.7倍 |
| Nicotiana benthamiana | benzylglucosinolate biosynthesis | APSK | adenosine 5-phosphosulfate kinase | 能量供给 | 提供PAPS辅底物，共表达使苯甲葡糖苷产量提高16倍 |
| Saccharomyces cerevisiae | indolylglucosinolate biosynthesis | 多基因途径 | 多种酶 | 催化 | 重构产生indolylglucosinolate，最高滴度1.07 mg/mL |
| Nicotiana tabacum | benzylglucosinolate biosynthesis | — | — | 催化 | 稳定表达途径产生苯甲葡糖苷，作为诱捕作物 |
关键发现
- 文森碱和长春新碱在干叶中的含量分别约为0.01%和0.003%
- 在periwinkle叶片表皮细胞中，严格斯啶浓度估计约10 mM
- 过表达转录因子CrWRKY1使serpentine产量增加3倍、ajmalicine增加10倍，色氨酸增加300倍
- 过表达反馈不敏感邻氨基苯甲酸合酶使tabersonine提高4.5倍、lochnericine提高2.1倍
- 在酵母中重构BIA途径，可产生S-reticuline达150 mg/L（Hawkins等）或40 mg/L（Nakagawa等）
- 共表达gamma-glutamyl peptidase使benzylglucosinolate产量提高5.7倍
- 共表达adenosine 5-phosphosulfate kinase提高16倍
- 在酵母中重构indolylglucosinolate途径，最高滴度达1.07 mg/mL
- 在烟草中稳定表达benzylglucosinolate，产率达0.5 nmol/mg鲜重。
研究结论
尽管植物代谢工程仍面临初级代谢与次生代谢平衡、基因沉默、区室化等挑战，但通过有效的基因挖掘、多基因表达技术、酶工程和代谢通路重构，已能在多种宿主中提高植物生物碱及类似物的产量，为工业化生产奠定了基础。未来需进一步整合调控元件、转运和区室化策略，实现更精准的代谢工程。