Strategies for terpenoid overproduction and new terpenoid discovery

作者: Guangkai Bian, Zixin Deng, Tiangang Liu
单位: Key Laboratory of Combinatorial Biosynthesis and Drug Discovery, Ministry of Education and School of Pharmaceutical Sciences, Wuhan University, Wuhan 430071, PR China; Hubei Engineering Laboratory for Synthetic Microbiology, Wuhan Institute of Biotechnology, Wuhan 430075, PR China
杂志: Current Opinion in Biotechnology（2017）
DOI: 10.1016/j.copbio.2017.07.002
所属领域: 代谢工程
关键词: combinatorial biosynthesisgenome miningin vitro reconstitutionmetabolic engineeringnew terpenoid discoveryterpenoid overproduction
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解决的核心问题

微生物系统中萜类化合物的高效过量生产以及新萜类化合物的高效挖掘。

研究策略

综述了体外重建策略指导的理性工程、组学指导的靶向工程、宿主与途径系统工程师，以及基于组合生物合成的基因组挖掘策略，用于萜类过量生产和新萜发现。

研究路线图

100%

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核心内容

该综述系统总结了微生物中萜类化合物过量生产与新萜类挖掘的核心策略。在过量生产方面，研究者提出体外重建途径以获取关键酶动力学参数，指导理性工程，例如通过体外重建MVA途径优化组分比例，在100升发酵罐中使番茄红素产量达1.23 g/L（34.3 mg/gDCW）。同时，整合组学指导的靶向工程与宿主全局改造，包括平衡乙酰辅酶A和氧化还原代谢、动态调控途径表达，如利用应激响应启动子控制法呢基焦磷酸合成，使紫穗槐二烯产量达1.6 g/L。此外，途径工程结合发酵优化也显著提升产量，如在解脂耶氏酵母中迭代整合多拷贝基因使β-胡萝卜素产量达4 g/L。在新萜类发现方面，组合生物合成平台充分利用萜烯环化酶的底物混杂性，通过理性位点突变创造新骨架，例如利用FgMS突变体F65L和F159G获得多种潜在新二倍半萜，FgGS则产生3个新骨架二萜。这些策略表明，体外重建与系统工程结合可有效突破合成瓶颈，而组合生物合成与蛋白工程的融合将加速新萜类结构的发掘，为高价值萜类化合物的微生物生产提供系统化路径。

创新点

提出体外重建指导靶向代谢工程以获取关键动力学参数；整合系统工程师与动态调控；利用组合生物合成平台释放萜类环化酶的混杂性，结合理性位点突变创造新骨架。

研究对象（18）

底盘细胞	代谢通路	基因	蛋白	功能	说明
Escherichia coli	MVA pathway	idi	Idi	催化	异戊烯基焦磷酸异构酶，体外重建确定最佳浓度，过表达提高番茄红素产量。
Escherichia coli	类胡萝卜素合成	crtE, crtB, crtI	CrtE, CrtB, CrtI	催化	番茄红素合成酶系。
Escherichia coli	虾青素合成	crtY, crtZ, crtW	CrtY, CrtZ, CrtW	催化	虾青素合成相关酶。
Saccharomyces cerevisiae	中心碳代谢	xPK, PTA, ADA, NADH-HMGr	xPK, PTA, ADA, NADH-HMGr	催化	重写中心碳代谢，降低ATP需求，提高法尼烯产量25%。
Escherichia coli	TCA循环	sucAB, gltA, sdhABCD	SucAB, GltA, SdhABCD	催化	协同工程TCA模块，增加ATP和NADPH供给。
Escherichia coli	磷酸戊糖途径	tktA, talB	TktA, TalB	催化	PPP模块，提供NADPH，协同工程提高β-胡萝卜素产量64%。
Escherichia coli	ATP合成途径	nuo, cyd, cyo, atp	Nuo, Cyd, Cyo, Atp	能量供给	增加ATP供应。
Saccharomyces cerevisiae	甾醇/类胡萝卜素竞争途径	ERG9	Erg9	催化	鲨烯合酶，动态调控以平衡FPP分配。
Escherichia coli	萜类外排	tolC	TolC	转运	外排泵，增加疏水萜类外排。
Aspergillus oryzae	萜类合成	EvSS	EvSS	催化	嵌合萜烯环化酶，发现新骨架variediene和cericerenes。
Aspergillus oryzae	萜类合成	NfSS	NfSS	催化	双功能萜烯合酶，产生新二倍半萜。
Escherichia coli	MVA途径/前体供给	FPPS, GGPPS, GFPPS	FPPS, GGPPS, GFPPS	催化	异戊烯基转移酶模块，提供不同链长前体。
Escherichia coli	萜类合成	FgMS	FgMS	催化	混杂性萜烯环化酶，产生35种萜类，突变F65L/F159G增强多样性。
Escherichia coli	萜类合成	FgGS	FgGS	催化	产生5种新二萜和3个新骨架。
Escherichia coli	二萜氧化	AtKO	AtKO	催化	ent-kaurene氧化酶，混杂性氧化。
Yarrowia lipolytica	β-胡萝卜素合成	—	多拷贝途径酶	催化	迭代整合多拷贝途径基因，β-胡萝卜素产量4 g/L。
Saccharomyces cerevisiae	番茄红素合成	crtE, crtYB	CrtE, CrtYB	催化	定向进化CrtE和CrtYB，产量1.61 g/L。
Saccharomyces cerevisiae	青蒿酸合成	P450, CPR	细胞色素P450, 还原酶	催化	优化P450和还原酶，提高青蒿酸产量。

关键发现

['通过多元模块法平衡上游MEP途径和下游萜类形成途径，紫杉二烯产量提高约15000倍（Ajikumar et al., 2010）。', '在酿酒酵母中，在细胞质和线粒体双重过表达MVA途径基因，异戊二烯产量达到2.5 g/L（Lv et al., 2016）。', '通过体外重建MVA途径获得关键信息（如Idi浓度、组分最适比例），指导工程化，在100-L发酵罐中番茄红素产量达1.23 g/L（34.3 mg/gDCW）（Zhu et al., 2015）。', '利用同一前体平台与最优CrtY/CrtZ/CrtW组合，在E. coli中一步构建获得虾青素最高产量8.64 mg/gDCW（Ma et al., 2016）。', '在酿酒酵母中引入xPK、PTA、ADA和NADH-HMGr四个非天然酶重写中心碳代谢，法尼烯产量提高25%，氧消耗降低75%（Meadows et al., 2016）。', '在E. coli中协同工程TCA循环（sucAB、gltA、sdhABCD）和磷酸戊糖途径（tktA、talB）以及ATP合成途径，β-胡萝卜素产量提高64%（Zhao et al., 2013）。', '工程化磷酸戊糖途径和Entner-Doudoroff途径为MEP途径提供前体和NADPH，使异戊烯醇产量提高1.9倍（Liu et al., 2014）。', '利用应激响应启动子动态调控法呢基焦磷酸生产，在E. coli中紫穗槐二烯产量提高两倍至1.6 g/L，无需昂贵诱导剂（Dahl et al., 2013）。', '基于顺序控制策略和CrtE及CrtYB定向进化，结合两阶段补料分批发酵，番茄红素产量达1.61 g/L（Xie et al., 2015）。', '通过敲除远距离遗传靶点并过表达转录因子，结合关键酶选择和途径优化，番茄红素产量提高22倍，最大达55.56 mg/gDCW（Chen et al., 2016）。', '在解脂耶氏酵母中迭代整合多拷贝途径基因并优化补料分批发酵，β-胡萝卜素产量达4 g/L（Gao et al., 2017）。', '利用组合生物合成平台，混杂性萜烯环化酶FgMS产生35种萜类，其中5种结构已知、2种新二倍半萜
FgGS产生5种新二萜，含3个新骨架
FgMS突变体F65L和F159G产生6种潜在新二倍半萜，其中1个被确认为新二倍半萜（Bian et al., 2017）。']

研究结论

体外重建提供了对限速步骤和工作机制的深入理解，为理性工程提供方向；系统工程师应整合靶向工程、乙酰-CoA和氧化还原平衡、动态调控等策略；新兴工具如CRISPR/Cas9和蛋白工程可进一步促进萜类过量生产；高效萜类生产平台与组合生物合成策略结合，可加速新萜烯环化酶和骨架的发现。