Leveraging microbial biosynthesis pathways for the generation of 'drop-in' biofuels
- 作者
- Amin Zargar, Constance B Bailey, Robert W Haushalter, Christopher B Eiben, Leonard Katz, Jay D Keasling
- 单位
- Joint BioEnergy Institute, Lawrence Berkeley National Laboratory; Physical Biosciences Division, Lawrence Berkeley National Laboratory; QB3 Institute, University of California-Berkeley; Synthetic Biology Engineering Research Center, University of California, Berkeley; Department of Chemical & Biomolecular Engineering, Department of Bioengineering, University of California, Berkeley; Novo Nordisk Foundation Center for Biosustainability, Technical University Denmark
- 杂志
- Current Opinion in Biotechnology（2017）
- DOI
- 10.1016/j.copbio.2017.03.004
- 所属领域
- 代谢工程 / 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
利用微生物生物合成途径生产与现有发动机兼容的'drop-in'生物燃料（汽油、柴油和喷气燃料），以替代石油基燃料并减少温室气体排放；同时解决目前生物燃料产量低、酶动力学慢、底物毒性等问题。
研究策略
综述了脂肪酸、异戊二烯和聚酮三类生物合成途径生产生物燃料的研究进展，重点讨论了醛脱羰酶、羧酸还原酶、萜烯合酶以及聚酮合酶的工程改造和代谢流优化策略。
核心内容
该文系统综述了利用微生物三大生物合成途径生产与现有发动机兼容的“drop-in”生物燃料（汽油、柴油和喷气燃料）的最新进展。针对生物燃料产量低、酶动力学慢和底物毒性等瓶颈，作者重点讨论了脂肪酸、异戊二烯和聚酮三类途径中关键酶如醛脱羰酶、羧酸还原酶、萜烯合酶及聚酮合酶的工程改造与代谢流优化策略。脂肪酸途径通过引入AAR/ADO或CAR等酶组合，在优化电子传递后于补料分批发酵中实现了1.26 g/L的烷烃产量，为目前最高报道；异戊二烯途径中，bisabolene在大肠杆菌发酵中达5.2 g/L，farnesene在摇瓶中也达到1.1 g/L；聚酮途径则利用模块化聚酮合酶的可编程性生产定制支链燃料，pentadecane产量为140 mg/L。综述指出，脂肪酸合酶途径产量最高，异戊二烯途径能量密度优势明显，而聚酮途径便于产品定制，实际应用中需依据燃料性能需求选择合适的生物合成路线，并进一步发展高通量筛选以提升酶动力学与代谢通量，推动生物燃料的商业化生产。
创新点
1) 利用醛脱羰酶（ADO）和羧酸还原酶（CAR）等将脂肪酸途径产物转化为烷烃；2) 利用结晶结构指导改造香叶基香叶基还原酶（GGR）实现双键氢化；3) 利用模块化聚酮合酶（PKS）的可编程性生产定制支链生物燃料，并优化AT结构域交换以维持酶活性。
研究对象（24）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | 脂肪酸生物合成 | ado | aldehyde decarbonylase (ADO) | 催化 | 将脂肪酸醛转化为烷烃，改进版来自Nostoc punctiforme |
| Escherichia coli | 脂肪酸生物合成 | aar | acyl-ACP reductase (AAR) | 催化 | 将脂肪酰-ACP直接还原为脂肪酸醛 |
| Escherichia coli | 脂肪酸生物合成 | car | carboxylic acid reductase (CAR) | 催化 | 将游离脂肪酸还原为脂肪酸醛，来自Mycobacterium marinum，热力学更有利 |
| Escherichia coli | 脂肪酸生物合成 | acr1 | fatty acyl-CoA reductase (ACR1) | 催化 | 将脂肪酰-CoA还原为脂肪酸醛，来自Clostridium acetobutylicum |
| Escherichia coli | 脂肪酸生物合成 | tesA | thioesterase (TesA) | 催化 | 将脂肪酰-ACP水解为游离脂肪酸 |
| Escherichia coli | 脂肪酸生物合成 | fadD | acyl-CoA ligase | 催化 | 将游离脂肪酸连接至CoA，促进后续还原 |
| Escherichia coli | 脂肪酸生物合成 | — | ferredoxin/ferredoxin reductase | 能量供给 | 为醛脱羰酶提供电子，增强催化速率 |
| Escherichia coli | 异戊二烯生物合成 | fpps | farnesyl pyrophosphate synthase (FPPS) | 催化 | 催化IPP和DMAPP缩合生成FPP |
| Escherichia coli | 异戊二烯生物合成 | bisabolene synthase | bisabolene synthase (BS) | 催化 | 催化FPP生成bisabolene，氢化后为bisabolane |
| Escherichia coli | 异戊二烯生物合成 | farnesene synthase | farnesene synthase (FS) | 催化 | 催化FPP生成farnesene，氢化后为farnesane |
| Escherichia coli | 异戊二烯生物合成 | gpps | geranyl pyrophosphate synthase (GPPS) | 催化 | 催化IPP和DMAPP生成GPP |
| Escherichia coli | 异戊二烯生物合成 | pinene synthase | pinene synthase (PS) | 催化 | 催化GPP生成pinene，二聚化后为喷气燃料 |
| Escherichia coli | 异戊二烯生物合成 | limonene synthase | limonene synthase (LS) | 催化 | 催化GPP环化生成limonene，氢化后为limonane |
| Escherichia coli | 异戊二烯生物合成 | gpps-ps | GPPS-PS fusion protein | 催化 | 融合蛋白缓解GPP对GPPS的抑制，pinene达32 mg/L |
| Saccharomyces cerevisiae | 异戊二烯生物合成 | bisabolene synthase | bisabolene synthase (BS) | 催化 | 在酵母中生产bisabolene，最高5.2 g/L（发酵） |
| Saccharomyces cerevisiae | 异戊二烯生物合成 | farnesene synthase | farnesene synthase (FS) | 催化 | 在酵母中生产farnesene，170 mg/L（fed-batch） |
| Streptomyces venezuelae | 异戊二烯生物合成 | bisabolene synthase | bisabolene synthase (BS) | 催化 | 工程菌株生产bisabolene，10 mg/L，比野生型总萜烯高两个数量级 |
| Sulfolobus acidocaldarius | 异戊二烯生物合成 | ggr | geranylgeranyl reductase (GGR) | 催化 | 催化GPP双键氢化，结晶结构指导突变提高氢化速率 |
| Escherichia coli | 聚酮生物合成 | — | iterative Type I PKS (Mycobacterium tuberculosis) | 催化 | 接受甲基丙二酰-CoA，生产多甲基支链酯，98 mg/L |
| Escherichia coli | 聚酮生物合成 | sgcE | iterative Type I PKS (SgcE) | 催化 | 与硫酯酶SgcE10共表达，在fed-batch中产pentadecane 140 mg/L |
| Escherichia coli | 聚酮生物合成 | sgcE10 | thioesterase (SgcE10) | 催化 | 切割PKS产物，优化表达比例提高产量 |
| Escherichia coli | 聚酮生物合成 | — | chimeric Type I PKS (borreledin PKS) | 催化 | 工程化改造用于生产己二酸 |
| Escherichia coli | 异戊二烯生物合成 | yceI | YceI transporter | 转运 | 来自Marinobacter aquaeolei，增加对pinene的耐受性 |
| Escherichia coli | 脂肪酸生物合成 | ahr | aldehyde reductase (AHR) | 催化 | 与ADO竞争醛底物，适度表达可刺激烷烃生成 |
关键发现
- 脂肪酸途径：通过AAR/ADO生产C13-C17烷烃达300 mg/L；通过硫酯酶和ACR1/ADO生产短链烷烃达580 mg/L；通过CAR和硫酯酶生产丙烷达32 mg/L；优化AHR和电子传递后在fed-batch中烷烃产量达1.26 g/L（最高报道）。异戊二烯途径：bisabolene在E. coli摇瓶达900 mg/L，在发酵中达5.2 g/L；在Streptomyces venezuelae中达10 mg/L（比野生型高两个数量级）；farnesene在E. coli摇瓶达1.1 g/L，在酵母fed-batch中为170 mg/L；pinene经GPPS-PS融合蛋白达32 mg/L；limonene经两相提取发酵达700 mg/L。聚酮途径：多甲基支链酯98 mg/L，pentadecane 140 mg/L。理论产率：烷烃30.7-30.8%、bisabolene
- 4%、多甲基支链酯27.2-27.6%、pentadecane
- 8%。脂肪酸最高titer为8.6 g/L。酶动力学：FAS合成棕榈酸<1秒，DEBS PKS约2分钟。
研究结论
要替代石油基燃料，必须提高生物燃料产量并降低原料成本，缩小底物生产与燃料合成之间的差距。通过发现和重新利用酶功能（如ADO）可创建新途径，但商业规模生产仍需改进酶动力学、毒性耐受和代谢通量。建议发展高通量筛选方法，并使代谢途径多样化：脂肪酸合酶可获得最高产量，异戊二烯具有高能量密度，聚酮可定制产品，应根据所需燃料性能选择合适的途径。