Metabolic engineering of Yarrowia lipolytica for industrial applications
- 作者
- Quin Zhu, Ethel N Jackson
- 单位
- Industrial Biosciences, E.I. du Pont de Nemours and Company, Wilmington, DE, USA
- 杂志
- Current Opinion in Biotechnology（2015）
- DOI
- 10.1016/j.copbio.2015.08.010
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
如何利用解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）作为底盘细胞，通过代谢工程高效生产源自乙酰CoA、脂肪酸和脂质的工业化学品（如生物柴油、功能性脂肪酸和类胡萝卜素），并实现商业化应用。
研究策略
系统综述了代谢工程策略，包括：优化内源脂质合成途径（过表达ACL、ACC1、PYC、DGAT2等）、解除负调控因子（SNF1、MIG1）、阻断β-氧化途径（敲除POX、PEX、MFE1）、引入异源去饱和酶/延长酶合成ω-3/ω-6功能性脂肪酸、引入类胡萝卜素合成途径，以及通过调控脂质体形成和脂肪酸转运（FAT1、TGL3/TGL4）提高脂质积累与储存能力。
核心内容
该综述系统评估了解脂耶氏酵母作为工业底盘细胞生产乙酰CoA衍生化学品的研究进展。作者梳理了脂质合成途径优化、负调控解除、β-氧化阻断及异源途径引入等代谢工程策略，并比较了各策略对脂质积累和产物合成的影响。在脂质生产方面，过表达ACC1与DGAT2的“推拉”策略使脂质含量达62%细胞干重，为理论产率的61%；在pex10/mfe1背景中过表达DGAT2更将脂质含量推至87%细胞干重。功能性脂肪酸方面，通过多拷贝整合与多基因共表达，商业菌株Z5567（41个拷贝、19个异源基因）的EPA含量达25%细胞干重、占总脂50%，并已实现Newharvest EPA油和Verlasso三文鱼的商业化。类胡萝卜素方面，在pox1-6/gut2突变株中番茄红素达16 mg/g细胞干重，β-胡萝卜素达5.7 mg/g细胞干重。结果表明，解脂耶氏酵母通过系统代谢工程可高效生产生物柴油前体、功能性脂肪酸和类胡萝卜素，已具备工业应用潜力，但进一步商业化仍有赖于降低原料成本并提升产率与转化率。
创新点
['首次实现利用解脂耶氏酵母代谢工程商业化生产EPA，开发了Newharvest EPA油和Verlasso三文鱼产品。', "通过'push-pull'策略（过表达ACC1和DGAT2）使脂质含量达到62% DCW，理论产率0.32 g/g葡萄糖的61%。", '通过阻断β-氧化和过表达DGAT2实现脂质含量高达87% DCW。', '构建了含41个拷贝、19个异源基因的EPA生产菌株Z5567，EPA含量达25% DCW。', '在解脂耶氏酵母中实现了番茄红素（16 mg/g DCW）和β-胡萝卜素（5.7 mg/g DCW）的异源生产。']
研究对象（27）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Yarrowia lipolytica | 脂质生物合成（乙酰CoA→脂肪酸→TAG） | ACL1 | ATP-柠檬酸裂解酶 | 催化 | 将胞质柠檬酸转化为乙酰CoA和草酰乙酸，是FA生物合成的关键酶 |
| Yarrowia lipolytica | 脂质生物合成 | ACC1 | 乙酰CoA羧化酶 | 催化 | 催化乙酰CoA→丙二酰CoA，FA合成的限速步骤 |
| Yarrowia lipolytica | 脂质生物合成 | PYC | 丙酮酸羧化酶 | 催化 | 过表达可增加脂质含量>20%，与ACL1共表达时脂质含量达45% DCW |
| Yarrowia lipolytica | TAG合成（Kennedy途径） | DGAT2 | 二酰甘油酰基转移酶2 | 催化 | TAG合成的关键酶，过表达使脂质含量显著提高 |
| Yarrowia lipolytica | TAG合成 | DGAT1 | 二酰甘油酰基转移酶1 | 催化 | 与DGAT2共同参与TAG合成，dgat1/dgat2/pdat三缺使脂质减少87% |
| Yarrowia lipolytica | TAG合成 | PDAT | 磷脂:二酰甘油酰基转移酶 | 催化 | 以磷脂和DAG为底物合成TAG |
| Yarrowia lipolytica | 脂质合成调控 | SNF1 | Snf1蛋白激酶 | 调控 | 脂质从头合成的负调控因子，snf1缺失使脂质含量提高2.6倍 |
| Yarrowia lipolytica | 脂质合成调控 | MIG1 | 转录抑制因子Mig1 | 调控 | SNF1网络中的抑制因子，mig1缺失使脂质含量达48.7% DCW |
| Yarrowia lipolytica | β-氧化 | POX1-POX6 | 酰基CoA氧化酶1-6 | 催化 | β-氧化第一步酶，敲除可增加脂质积累，pox2/3/5缺失菌中表达POX2使脂质体几乎充满细胞 |
| Yarrowia lipolytica | 过氧化物酶体生物发生/β-氧化 | PEX10 | 过氧化物酶体生物发生因子10 | 区室化 | PEX10缺失消除β-氧化，与DGAT2过表达组合使脂质含量达52% DCW |
| Yarrowia lipolytica | β-氧化 | MFE1 | 羟酰辅酶A脱氢酶 | 催化 | 过氧化物酶体β-氧化酶，pex10/mfe1菌株中过表达DGAT2使脂质含量达87% DCW |
| Yarrowia lipolytica | 甘油代谢/G3P穿梭 | GUT2 | 线粒体甘油-3-磷酸脱氢酶 | 催化 | GUT2缺失可增加G3P池，促进ex novo脂质积累 |
| Yarrowia lipolytica | 甘油代谢/G3P合成 | GPD1 | 胞质甘油-3-磷酸脱氢酶 | 催化 | 过表达GPD1增加G3P供应，与阻断β-氧化结合使脂质积累达80% DCW |
| Yarrowia lipolytica | 脂肪酸转运/输出 | FAT1 | 脂肪酸转运蛋白Fat1p | 转运 | 定位于脂质体，参与脂肪酸输出，FAT1突变使脂质含量提高54% |
| Yarrowia lipolytica | TAG脂解 | TGL3 | TAG脂肪酶3 | 催化 | 脂质体定位的TAG脂肪酶，敲除可增强脂质积累能力 |
| Yarrowia lipolytica | TAG脂解 | TGL4 | TAG脂肪酶4 | 催化 | 另一脂质体定位的TAG脂肪酶，与TGL3功能互补，敲除使积累能力翻倍 |
| Yarrowia lipolytica | ω-6/ω-3脂肪酸合成 | D12D | Δ12-脂肪酸脱饱和酶 | 催化 | 将油酸转化为亚油酸，是GLA合成途径第一步 |
| Yarrowia lipolytica | ω-6/ω-3脂肪酸合成 | D6D | Δ6-脂肪酸脱饱和酶 | 催化 | 将亚油酸转化为γ-亚麻酸（GLA），与D12D共表达使GLA>25%总脂 |
| Yarrowia lipolytica | 脂肪酸延长 | C16E | C16/C18脂肪酸延长酶 | 催化 | 来自Mortierella alpina，用于延长C16/18脂肪酸，提高GLA、DGLA产量 |
| Yarrowia lipolytica | ω-3脂肪酸合成 | D17D | Δ17-脂肪酸脱饱和酶 | 催化 | 将ARA转化为EPA，多拷贝表达可'拉动'EPA生物合成 |
| Yarrowia lipolytica | DHA合成 | D4D | Δ4-脂肪酸脱饱和酶 | 催化 | 用于合成DHA，与C20E共表达产生DHA/DPA/EPA混合物 |
| Yarrowia lipolytica | DHA合成 | C20E | C20脂肪酸延长酶 | 催化 | 将EPA延长为DPA，再经D4D生成DHA |
| Yarrowia lipolytica | 类胡萝卜素合成 | CrtE | GGPP合酶 | 催化 | 催化IPP/DMAPP→GGPP，类胡萝卜素合成第一步 |
| Yarrowia lipolytica | 类胡萝卜素合成 | CrtB | 八氢番茄红素合酶 | 催化 | 催化GGPP→八氢番茄红素 |
| Yarrowia lipolytica | 类胡萝卜素合成 | CrtI | 八氢番茄红素脱饱和酶 | 催化 | 催化八氢番茄红素→番茄红素 |
| Yarrowia lipolytica | 类胡萝卜素合成 | CrtY | 番茄红素环化酶 | 催化 | 催化番茄红素→β-胡萝卜素 |
| Yarrowia lipolytica | 甲羟戊酸途径 | HMG | HMG-CoA还原酶 | 催化 | 甲羟戊酸途径限速酶，截短HMG过表达可提高类胡萝卜素产量 |
关键发现
- 过表达PYC和ACL1使脂质含量达45% DCW，较亲本提高约50%
- snf1缺失突变体脂质含量提高2.6倍
- mig1突变体脂质含量达48.7% DCW（WT为36%）
- dgat2或dgat1/dgat2/pdat缺失使脂质含量降低64%或87%
- 过表达DGAT2在WT和pex10菌株中分别使脂质含量达38%和52% DCW，同时过表达ACC1和DGAT2时脂质含量达62% DCW，脂质产率为0.195 g/g葡萄糖，为理论最大产率（0.32 g/g）的61%
- 在pex10/mfe1菌株中过表达DGAT2使脂质含量达87% DCW
- 通过GUT2缺失或GPD1过表达（同时阻断β-氧化）使ex novo脂质积累达80% DCW
- FAT1突变使脂质含量提高54%
- 敲除TGL3/TGL4脂肪酶使脂质积累能力翻倍。在功能性脂肪酸方面，共表达D12D和D6D使GLA含量超过25%总脂
- 提高基因拷贝数后DGLA达42%、ARA达35%
- EPA菌株Y4305（30个拷贝、9个基因）EPA含量为56.6%总脂、约15% DCW，商业菌株Z5567（41个拷贝、19个基因）EPA含量为50%总脂、25% DCW
- DHA菌株产生约5% DHA、13.5% DPA和26.5% EPA。类胡萝卜素方面，共表达CrtE/CrtB/CrtI在EPA菌株中积累番茄红素2 mg/g DCW，在pox1-6/gut2突变株中达16 mg/g DCW（fed-batch）
- 共表达CrtE/CrtB/CrtI/CrtY使β-胡萝卜素达5.7 mg/g DCW，占总类胡萝卜素的64%。
研究结论
解脂耶氏酵母是生产乙酰CoA、脂肪酸和脂质衍生化学品的优越工业宿主，已成功用于EPA等产品的商业化生产；通过代谢工程优化内源途径和引入异源途径，可高效生产生物柴油前体、功能性脂肪酸和类胡萝卜素，但实现更广泛商业应用仍需降低底物成本和工程化开发成本，并进一步提升产率、滴度和转化率。