Biosystems Design of Corynebacterium glutamicum for Bio-Production
- 作者
- Jian Zha, Zhen Zhao, Zhengyang Xiao, Thomas Eng, Aindrila Mukhopadhyay, Mattheos A.G. Koffas, Yinjie J. Tang
- 单位
- School of Food and Biological Engineering, Shaanxi University of Science and Technology, Xi'an, Shaanxi 710021, China; Department of Energy, Environmental and Chemical Engineering, Washington University in Saint Louis, Missouri 63130, USA; Department of Chemical and Biological Engineering, Rensselaer Polytechnic Institute, Troy, New York 12180, USA; Center for Biotechnology and Interdisciplinary Studies, Rensselaer Polytechnic Institute, Troy, New York 12180, USA; Biological Systems and Engineering Division, Lawrence Berkeley National Laboratory, Berkeley, CA, USA
- 杂志
- Current Opinion in Biotechnology（2023）
- DOI
- 10.1016/j.copbio.2022.102870
- 所属领域
- 代谢工程 / 合成生物学
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
如何系统设计与改造谷氨酸棒状杆菌，使其高效生产氨基酸衍生物、大宗化学品和天然产物等多样目标化合物。
研究策略
综述了谷氨酸棒状杆菌生物系统设计的最新进展，包括初级代谢物与天然产物合成、非模式底物利用、CRISPR基因编辑与调控工具（Cas12a、碱基编辑器、CRISPRi、sRNA）、生物传感器、多尺度代谢模型与组学分析，以及新型菌株开发等，并展望未来研究方向。
核心内容
该综述系统总结了谷氨酸棒状杆菌作为工业底盘细胞的系统设计与改造策略。在工具开发方面，研究梳理了高效无毒的Cas12a编辑系统、将PAM要求从NGG放宽至NG的碱基编辑器（靶点范围扩大3.9倍），以及基于dCas9的CRISPRi高通量筛选和合成sRNA敲低等技术，并建立了包含773个基因、950个代谢物和1207个反应的基因组规模模型iCW773。应用层面，工程菌株实现了多种产物的高效合成：戊二酸达105 g/L，5-羟基戊酸52 g/L，透明质酸28.7 g/L；新分离株S9114合成N-乙酰氨基葡萄糖达6.9 g/L，而模式菌株仅0.5 g/L；异戊烯醇产量在BRC-JBEI 1.1.1中较ATCC 13032提高约20倍。此外，甘油利用工程实现1.34 g/g DCW/h的消耗速率，组学指导的腐胺改造使产量提升30%。这些进展表明，结合先进编辑工具、生物传感器与多尺度模型，谷氨酸棒状杆菌正逐步成为生产氨基酸衍生物及大宗化学品的通用平台，但天然产物产量仍偏低，需借助转运工程和模块化途径优化进一步突破。
创新点
系统总结了用于谷氨酸棒状杆菌的先进工具：高效且无毒的Cas12a基因编辑、可扩展靶点的碱基编辑器（PAM要求从NGG放宽到NG，靶点增加3.9倍）、基于dCas9的CRISPRi高通量基因功能筛选（如测试74个基因）、合成sRNA敲低系统、感应GGPP的生物传感器CrtR/PcrtE，以及基因组规模模型iCW773（773基因、950代谢物、1207反应）指导的产物工程；同时强调新分离株（如S9114和BRC-JBEI 1.1.2）具有超越模式菌株的潜力。
研究对象（12）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Corynebacterium glutamicum | 5-羟基戊酸生物合成 | davTBA | — | 催化 | 异源表达davTBA负责从赖氨酸形成氨基戊酰胺，再经醛还原酶生成5-羟基戊酸，产量52 g/L |
| Corynebacterium glutamicum | 戊二酸生物合成 | — | — | 催化 | 表达铜绿假单胞菌的L-赖氨酸分解代谢途径，将L-赖氨酸转化为戊二酸，产量105 g/L |
| Corynebacterium glutamicum | 甘油利用 | glpF | aquaglyceroporin | 转运 | 甘油转运蛋白，优化表达后甘油利用速率达1.34 g/g DCW/h |
| Corynebacterium glutamicum | 甘油利用 | dhaD | glycerol dehydrogenase | 催化 | 甘油脱氢酶，催化甘油氧化为二羟丙酮 |
| Corynebacterium glutamicum | 甘油利用 | dhaK | ATP-dependent dihydroxyacetone kinase | 催化 | ATP依赖的二羟丙酮激酶，使二羟丙酮进入糖酵解 |
| Corynebacterium glutamicum | CRISPR基因编辑 | cas12a | Cas12a (Cpf1) | 催化 | 来自Francisella novicida，无毒且高效，识别5'-NYTV-3' PAM序列诱导双链断裂 |
| Corynebacterium glutamicum | CRISPR碱基编辑 | cas9 | dead Cas9-cytosine deaminase (CDA) / adenine deaminase (AID) | 催化 | 催化失活的Cas9与脱氨酶融合实现C:G→T:A或A:T→G:C精确碱基编辑 |
| Corynebacterium glutamicum | CRISPRi基因表达干扰 | dCas9 | catalytically-dead Cas9 | 调控 | 结合靶序列但不切割DNA，抑制靶基因转录 |
| Corynebacterium glutamicum | 类胡萝卜素生物合成 | crt | CrtR | 调控 | MarR型转录因子CrtR感应GGPP并抑制crt操纵子启动子PcrtE，可用作生物传感器 |
| Corynebacterium glutamicum | sRNA基因敲低 | hfq | Hfq | 调控 | RNA伴侣蛋白，协助合成sRNA与靶mRNA结合从而抑制翻译 |
| Corynebacterium glutamicum S9114 | N-乙酰氨基葡萄糖合成 | gna1 | glucosamine-6-phosphate acetyltransferase | 催化 | 来自秀丽隐杆线虫的GNA1基因异源表达，S9114中GlcNAc产量3.0 g/L（ATCC 13032为0.5 g/L），进一步优化达6.9 g/L |
| Corynebacterium glutamicum BRC-JBEI 1.1.2 | 异戊烯醇生产 | — | — | 催化 | 测试5基因异戊烯醇途径，产量比ATCC 13032高约20倍（ATCC检测下限15 mg/L） |
关键发现
谷氨酸棒状杆菌经工程改造可实现多种化合物的高效生产：5-羟基戊酸52 g/L，戊二酸105 g/L，透明质酸28.7 g/L（分子量0.21-0.97 MDa），γ-氨基丁酸23 g/L，N-乙酰氨基葡萄糖在S9114中达6.9 g/L（ATCC 13032仅0.5 g/L），异戊烯醇在BRC-JBEI 1.1.2中比ATCC 13032高约20倍（ATCC检测下限15 mg/L）。甘油利用工程（glpF、dhaD、dhaK）实现1.34 g/g DCW/h的利用速率和0.37 h^-1的最大比生长速率。组学指导的腐胺工程使产量提高30%。CRISPRi筛选74个基因发现类胡萝卜素生产新靶点。模型iCW773预测透明质酸和GABA生产分别达28.7 g/L和23 g/L。
研究结论
谷氨酸棒状杆菌是生产多种氨基酸、有机酸、短链醇及其衍生物的理想工业底盘，在天然产物合成中也有应用潜力。但它并非所有化合物的最佳宿主，特别是天然产物产量较低，需通过转运工程、细胞壁重塑、酶修饰和模块化途径工程等策略提升。未来，先进的代谢模型和人工智能技术将加速其成为通用细胞工厂。