Biotechnological production of hyperforin for pharmaceutical formulation
- 作者
- Mariam Gaid, Eline Biedermann, Jendrik Füller, Paul Haas, Sönke Behrends, Rainer Krull, Stephan Scholl, Ute Wittstock, Christel Müller-Goymann, Ludger Beerhues
- 单位
- Institute of Pharmaceutical Biology, Technische Universität Braunschweig, Germany; Institute of Pharmaceutical Technology, Technische Universität Braunschweig, Germany; Institute of Chemical and Thermal Process Engineering, Technische Universität Braunschweig, Germany; Institute of Pharmacology, Toxicology and Clinical Pharmacy, Technische Universität Braunschweig, Germany; Institute of Biochemical Engineering, Technische Universität Braunschweig, Germany; Center of Pharmaceutical Engineering, Technische Universität Braunschweig, Germany
- 杂志
- European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics（2017）
- DOI
- 10.1016/j.ejpb.2017.03.024
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
hyperforin 是贯叶金丝桃的主要活性成分，具有抗抑郁等多种药理活性，但化学结构复杂、对氧/光/热不稳定，化学合成难度大且产率低，传统提取受环境和原料波动影响，难以稳定满足医药制剂需求，亟需发展可控的生物技术生产途径。
研究策略
综述围绕 hyperforin 的生物技术生产展开，系统总结了多种体外培养体系（细胞悬浮、芽、根培养）及异源生产策略（酵母、昆虫细胞、本氏烟等表达系统），同时结合基因发掘（转录组学、功能表征）尝试重建其生物合成途径，并探讨了提取稳定化与制剂策略。
核心内容
贯叶金丝桃中的贯叶金丝桃素（hyperforin）具有抗抑郁等多种药理活性，但因结构复杂且稳定性差，化学合成和传统提取均难以满足医药制剂需求。该综述系统梳理了利用生物技术生产该化合物的多种途径，重点构建了贯叶金丝桃不定根培养体系，其提取产量达5 mg/g DW，摇瓶培养6周后产率约50 mg/L，且该体系同时积累hyperforin衍生物和典型的啤酒花成分lupulones，却不产生hypericins，形成了前所未有的成分组合。研究还评估了异源表达策略，发现芳香族异戊烯基转移酶LePGT1在昆虫细胞Sf9中的表达量可达酵母体系的1000倍。此外，培养条件优化显示，在芽培养中模拟剪切应力可使hyperforin产量提升5倍至30–35 mg/g DW，而超临界CO2提取可获得含38.8% hyperforin的提取物。这些结果表明，借助体外培养与异源生物合成途径重建，能够为hyperforin提供可控、可持续的生产平台，未来结合基因解析与代谢工程改造，有望进一步提升产量并拓展其药理应用。
创新点
建立了能生产 hyperforin 的贯叶金丝桃不定根培养体系（提取产量5 mg/g DW，摇瓶产率约50 mg/L）；发现该根培养同时产生 lupulones（典型啤酒花成分），形成前所未有的成分组合；系统评估了异源表达芳香族异戊烯基转移酶的可行性（如 LePGT1 在 Sf9 中表达量为酵母的1000倍）；提出通过基因鉴定和代谢工程改造 hyperforin 结构、扩大药理谱的新方向。
研究对象（11）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Hypericum perforatum 不定根培养 | hyperforin 生物合成 | — | — | 区室化 | 产生 hyperforin 5 mg/g DW 和约 50 mg/L，不含 hypericins，同时积累 lupulones |
| 酵母 (Saccharomyces cerevisiae) | 异源表达 | — | — | 区室化 | 作为芳香族异戊烯基转移酶的异源表达宿主，部分酶表达成功 |
| 昆虫细胞 Sf9 (Spodoptera frugiperda) | 异源表达 | — | — | 区室化 | LePGT1 表达水平为酵母的 1000 倍，适合膜结合酶表达 |
| 本氏烟 (Nicotiana benthamiana) | 异源表达 | — | — | 区室化 | 瞬时表达香豆素特异性异戊烯基转移酶成功，弥补酵母表达失败 |
| — | hyperforin 生物合成 | PKS (type III polyketide synthase) | type III polyketide synthase | 催化 | 催化 isobutyryl-CoA 与 3 分子 malonyl-CoA 缩合生成 phlorisobutyrophenone |
| — | colupulone/蛇麻酮生物合成 | HIPT-1 | aromatic prenyltransferase | 催化 | 来自啤酒花，催化苦味酸生物合成中的异戊烯化步骤 |
| — | 紫草素生物合成 | LePGT1 | p-hydroxybenzoate:geranyltransferase | 催化 | 内质网定位，催化对羟基苯甲酸香叶基化 |
| — | 氧杂蒽酮生物合成 | xanthone-specific prenyltransferase (H. calycinum) | aromatic prenyltransferase | 催化 | 催化 1,3,6,7-tetrahydroxyxanthone 的 C-8 异戊烯化 |
| — | 黄酮/氧杂蒽酮生物合成 | Morus alba isoliquiritigenin 3'-dimethylallyltransferase | aromatic prenyltransferase | 催化 | 催化 1,3,7-trihydroxyxanthone 的 C-2 异戊烯化 |
| — | 呋喃香豆素生物合成 | Petroselinum crispum prenyltransferase | aromatic prenyltransferase | 催化 | 香豆素特异性，在酵母中表达失败，在本氏烟中瞬时表达成功 |
| — | 氧杂蒽酮生物合成 | CYP81AA | CYP81AA protein | 催化 | 双功能酶，催化羟基化和区域选择性酚偶联 |
关键发现
- ['贯叶金丝桃不定根培养的 hyperforin 提取产量为 5 mg/g DW，摇瓶规模6周后产率约 50 mg/L 培养物。', '根培养中 hyperforin 类化合物（seco-、adsecohyperforins）和 lupulones（colupulone、adlupulone）持续积累，且不含 hypericins。', '超临界 CO2 提取可获得含
- 8% hyperforin 的提取物（300 bar 时
- 9 mg/g DW），亚临界条件（70 bar）为
- 1 mg/g DW。', 'LePGT1（对羟基苯甲酸香叶基转移酶）在 Sf9 昆虫细胞中的表达水平是酵母的 1000 倍。', '在芽培养中加入琼脂块和软木塞模拟剪切应力，使 hyperforin 产量提高 5 倍（30-35 mg/g DW），hypericin 产量提高 3 倍（10-21 mg/g DW）。', '甲基茉莉酸酯（350 μM）处理根培养使 hypericin 产量最大达
- 68 mg/g DW，与1年生田间植物相比提高 6 倍，与体外苗相比提高 11 倍。', '臭氧处理（3 h, 90 nL/L）使 hypericin 产量增加 4 倍（约 29 mg/L）。', '饲喂异亮氨酸或苏氨酸（2 mM）使芽培养中 adhyperforin 产量增加 2-3.7 倍。', 'hyperforin 对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的 MIC 为 1 μg/ml，对白喉棒杆菌最低抑菌浓度为
- 1 μg/ml。', '在 HaCaT 角质细胞中，10 μM hyperforin 在 10% FBS 存在下导致约 60% 的细胞活力丧失，主要为抗增殖效应而非细胞毒性。']
研究结论
贯叶金丝桃制剂市场地位稳固，hyperforin 结构特殊、药理潜力巨大，但产量和稳定性是瓶颈。通过体外培养（尤其是根培养）和异源生物合成途径的重建，可提供可控、可持续的生产平台；根培养不仅可生产 hyperforin 及其衍生物，还能产生 lupulones 等新型成分组合。未来需进一步解析生物合成基因，借助合成生物学实现大规模生产并拓展药理应用。