Optimizing Cupriavidus necator H16 as a host for aerobic C1 conversion
- 作者
- Stefano Donati, Christopher W Johnson
- 单位
- The Novo Nordisk Foundation Center for Biosustainability, Technical University of Denmark; Renewable Resources and Enabling Sciences Center, National Renewable Energy Laboratory
- 杂志
- Current Opinion in Biotechnology（2025）
- DOI
- 10.1016/j.copbio.2025.103306
- 所属领域
- 代谢工程 / 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
如何将兼性化能自养菌 Cupriavidus necator H16 优化为好氧 C1（CO2、甲酸、甲醇、CO 等）生物转化平台宿主，以实现高效的碳固定与产物合成。
研究策略
综述并整合 C. necator 的天然优势（代谢多功能性、高细胞密度生长、遗传可操作性），结合适应性实验室进化（ALE）、基因组最小化、CRISPR-Cas9 编辑、异源途径导入（如作羧化酶、碳酸酐酶、HCO3-转运蛋白、磷酸转酮酶、还原性甘氨酸途径）等策略提升其 C1 转化能力。
研究路线图
核心内容
该研究系统梳理了将兼性化能自养菌Cupriavidus necator H16优化为好氧C1生物转化平台宿主的多种策略。作者整合了该菌株天然具备的代谢多功能性、高细胞密度生长能力和遗传可操作性等优势，通过适应性实验室进化、基因组最小化、CRISPR-Cas9基因编辑及异源途径导入等手段，逐一改善其对CO2、甲酸和CO等C1底物的利用能力。关键进展包括：删除限制酶基因使电穿孔转化效率从约25 CFU/μg DNA跃升至超过40,000 CFU/μg DNA，并首次实现该菌的CRISPR-Cas9编辑；异源表达磷酸转酮酶使甲酸底物下的生物量得率提高30%；以合成还原性甘氨酸途径替代天然CBB循环后，经多轮工程和进化，菌株产量比野生型CBB高17%。此外，利用CO2/H2生产PHB的最高速率和滴度分别达到1.55 g/L/h和61.9 g/L（占细胞干重67.7%），高细胞密度发酵可达281 g/L CDW。这些结果表明，C. necator已成长为最具潜力的好氧C1转化底盘之一，为未来以C1原料驱动循环生物经济、生产燃料、化学品和食品奠定了重要基础。
创新点
['删除限制酶基因 H16_A0006 将电穿孔转化效率从约25 CFU/μg DNA提高到>40,000 CFU/μg DNA，并首次实现 C. necator 的 CRISPR-Cas9 编辑', '结合改进方法后转化效率达到>10^7 CFU/μg DNA', '利用 ALE 揭示并删除 pHG1 大质粒可改善甲酸生长', '异源表达磷酸转酮酶将甲酸生物量得率提高30%', '用合成还原性甘氨酸途径(rGP)替代天然CBB循环，最终产量比野生型CBB高17%', '异源表达蓝细菌 RuBisCO 或 HCO3-转运蛋白/碳酸酐酶改善 CO2 固定', '通过 ALE 提高 CO 耐受性']
研究对象（15）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Cupriavidus necator H16 | Calvin-Benson-Bassham (CBB) cycle | — | RuBisCO (ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase) | 催化 | CO2固定的关键酶，含有两个拷贝（染色体2和pHG1） |
| Cupriavidus necator H16 | 氢代谢 / CBB循环能量供给 | — | 可溶性氢化酶 (SH) | 能量供给 | 氧化H2产生还原力驱动CBB循环 |
| Cupriavidus necator H16 | 氢代谢 / CBB循环能量供给 | — | 膜结合氢化酶 (MBH) | 能量供给 | 氧化H2产生还原力驱动CBB循环 |
| Cupriavidus necator H16 | 甲酸代谢 | — | 甲酸脱氢酶 (FDH) | 催化 | 将甲酸氧化为CO2并提供还原力 |
| Cupriavidus necator H16 | CBB循环 / 乙酰-CoA合成 | — | 磷酸转酮酶 (phosphoketolase) | 催化 | 异源表达，绕过丙酮酸脱羧损失，使甲酸生物量得率提高30% |
| Cupriavidus necator H16 | CO2浓缩机制 | — | 碳酸酐酶 (CA) | 催化 | 异源或内源表达，促进HCO3-与CO2互变，改善CO2固定 |
| Cupriavidus necator H16 | CO2浓缩机制 | — | 碳酸氢盐转运蛋白 (HCO3- transporter) | 转运 | 异源表达，将HCO3-转运过膜，提高CO2周围浓度 |
| Cupriavidus necator H16 | CBB循环调控 | cbbR | CbbR | 调控 | CBB操纵子的转录激活因子，过表达可改善自养生长 |
| Cupriavidus necator H16 | CBB循环调控 | regA | RegA | 调控 | CBB操纵子的转录调控因子，过表达可改善自养生长 |
| Cupriavidus necator H16 | 运动与鞭毛合成调控 | phcA | PhcA | 调控 | 转录因子，缺失可减少运动相关基因表达，改善甲酸生长 |
| Cupriavidus necator H16 | DNA限制修饰系统 | H16_A0006 | 限制酶 | 催化 | 删除该限制酶基因使转化效率提高1658倍，达>40,000 CFU/μg DNA |
| Cupriavidus necator H16 | 甲醇代谢（来自C. necator N-1） | mdh2 | Mdh2 | 催化 | 甲醇脱氢酶，可转化甲醇为甲醛，但H16无此基因 |
| Cupriavidus necator H16 | CO代谢 | — | CO脱氢酶 (CODH) | 催化 | 异源表达或表面展示使C. necator获得CO利用能力 |
| Cupriavidus necator H16 | PHA生物合成 | phbC | PHA聚合酶 (PhaC) | 催化 | PHB聚合酶，负责PHB合成；C. necator商业化生产PHB的关键酶 |
| Cupriavidus necator H16 | 合成还原性甘氨酸途径 (rGP) | — | rGP途径酶系 | 催化 | 异源替代CBB循环，经多轮工程后产量比野生型CBB高17% |
关键发现
- ['C. necator H16 在有机酸、CO2/H2 和甲酸上的最大比生长速率分别为
- 34 h-1、0.32 h-1 和
- 18 h-1；ALE 后甲酸生长速率提高到
- 21 h-1 和
- 25 h-1', '高细胞密度发酵可达 281 g/L CDW（葡萄糖，NCIMB 11599）和 91 g/L CDW（CO2/H2，ATCC 17697，40小时）', '利用 CO2/H2 生产 PHB 的最高速率和滴度达到
- 55 g/L/h 和
- 9 g/L（占 CDW
- 7%）；气升式反应器中达
- 4 g/L（占 CDW
- 4%，1.06 g/L/h）', '删除限制酶基因和优化电穿孔后转化效率从约25 CFU/μg DNA提高到>40,000，进一步组合方法达>10^7 CFU/μg DNA', '异源表达磷酸转酮酶使甲酸为底物时的生物量得率提高30%', '用还原性甘氨酸途径替代 CBB 后，经多轮工程和 ALE 菌株产量比野生型 CBB 高17%', '异源表达 HCO3-转运蛋白或碳酸酐酶在批次培养中可提高 CO2 条件下的生物量积累', 'C. necator 蛋白含量最高可达 CDW 的70%，氨基酸谱接近乳清、大豆和酪蛋白']
研究结论
C. necator H16 凭借其代谢多功能性、快速高密度生长和遗传可操作性，已成为最具潜力的好氧 C1 转化底盘之一。通过合成生物学和适应性进化，其 CO2 和甲酸利用能力不断提升，未来有望在循环生物经济中实现将 C1 原料转化为燃料、化学品、材料和食品。