Expression of aspartic protease from Neurospora crassa in industrial ethanol-producing yeast and its application in ethanol production
- 作者
- Zhong-peng Guo, Chong-yan Qiu, Liang Zhang, Zhong-yang Ding, Zheng-Xiang Wang, Gui-Yang Shi
- 单位
- The Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, Center for Bioresources & Bioenergy, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, PR China
- 杂志
- Enzyme and Microbial Technology（2010）
- DOI
- 10.1016/j.enzmictec.2010.10.008
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
工业乙醇酵母在超高浓度（VHG）生淀粉发酵中缺乏降解蛋白质的能力，导致游离氨基氮（FAN）不足，酵母生长缓慢、发酵时间长、乙醇产量低，原料利用率受限。
研究策略
克隆粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）的天冬氨酸蛋白酶基因Asp，与酿酒酵母α-因子信号肽融合并在PGK1启动子下组成型表达；随后将成熟蛋白与α-凝集素融合，将酸性蛋白酶锚定在工业乙醇酵母细胞表面，构建表面展示重组菌，并在澄清玉米浆和50%生玉米淀粉VHG发酵中评价其效果。
核心内容
该研究将粗糙脉孢菌的天冬氨酸蛋白酶基因Asp与α-因子信号肽融合，在PGK1启动子下于工业乙醇酵母中组成型分泌表达，并通过与α-凝集素融合将成熟酶锚定于细胞表面，构建了表面展示重组菌CICIMY0086-2。分泌型菌株APS酶活为6.8 U/ml，最适pH 4.0、温度45°C；表面展示菌株细胞壁酶活达14.26 U/g，上清无活性。在澄清玉米浆低FAN发酵中，重组菌平均发酵速率1.83 g葡萄糖/h、乙醇产量0.496 g/g葡萄糖，均优于野生型；补加外源蛋白酶的野生型虽获最高产量50.2 g/100 g糖（理论值98–99%），但重组菌无需额外补酶即可接近该水平。在50%生玉米淀粉VHG发酵中，重组菌最大比生长速率0.33 h⁻¹（野生型0.24 h⁻¹），乙醇浓度达14.8% v/v（野生型13.8%），发酵时间缩短至62 h，乙醇产量提高7.2%，总残糖降至3.57 g/100 ml。结果表明表面展示天冬氨酸蛋白酶可有效降解生淀粉中蛋白质，释放FAN促进酵母生长，降低粘度并显著提升VHG生淀粉乙醇发酵效率，具备工业应用潜力。
创新点
首次在工业乙醇生产酵母中表达并表面展示粗糙脉孢菌天冬氨酸蛋白酶；采用细胞表面展示策略避免游离酸性蛋白酶对生淀粉淀粉酶的降解；在VHG生淀粉发酵中证实该策略可提高FAN含量、降低培养基粘度、缩短发酵时间并提高乙醇产量。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae CICIMY0086 | 乙醇发酵 | Asp | 天冬氨酸蛋白酶 | 催化 | 来源于Neurospora crassa，克隆后在工业乙醇酵母中表达并展示于细胞表面，用于降解原料蛋白质提供FAN |
| Saccharomyces cerevisiae CICIMY0086 | 蛋白降解/氮源代谢 | AGα1（α-凝集素基因） | α-凝集素 | 区室化 | C端与天冬氨酸蛋白酶融合，将其锚定在细胞壁上 |
| Saccharomyces cerevisiae CICIMY0086 | 基因表达 | PGK1 promoter | — | 调控 | 来自酿酒酵母的磷酸甘油酸激酶启动子，驱动组成型表达 |
| Saccharomyces cerevisiae CICIMY0086 | 蛋白分泌 | α-factor信号序列 | α-因子信号肽 | 转运 | 用于引导蛋白分泌（最终用于表面展示构建） |
关键发现
- 分泌表达菌株APS的酸性蛋白酶活力为6.8±0.21 U/ml，最适pH 4.0、最适温度45°C
- 野生型无检测活性。表面展示菌株CICIMY0086-2的细胞沉淀和细胞壁酶活分别为11.78±0.23 U/g和14.26±0.19 U/g，上清无活性。在澄清玉米浆发酵（低FAN 50 mg/L）中，重组菌平均发酵速率1.83 g葡萄糖/h，乙醇产量0.496 g/g葡萄糖，总残糖0.11 g/100 ml
- 野生型分别为1.52 g/h、0.456 g/g、0.87 g/100 ml
- 补加酸性蛋白酶的野生型分别为2.15 g/h、0.505 g/g、0.06 g/100 ml，最高乙醇产量达50.2-50.5 g/100 g糖（理论值的98-99%），而对照组仅45.3-45.9 g/L（约89%理论值）。重组菌OD在24 h达14.0，野生型补加酶组最高OD 20（36 h）。在50%生玉米淀粉发酵中，重组菌最大比生长速率0.33 h^-1（野生型0.24 h^-1），活细胞数达3.2×10^8 CFU/ml（20 h，野生型2.7×10^8 CFU/ml，28 h），乙醇浓度14.8% v/v（野生型13.8%），总残糖3.57 g/100 ml（野生型4.46），发酵时间缩短至62 h（野生型72 h），乙醇产量提高7.2%
- 重组菌AP值全程>2.8，而野生型72 h时降到1.8以下
- 重组菌细胞干重10.88 g（野生10.12 g），生长产量0.544 g/g葡萄糖（野生0.506），蛋白含量56.95 g/100 g生物量（野生55.47）。
研究结论
在工业乙醇酵母细胞表面展示粗糙脉孢菌天冬氨酸蛋白酶，可有效降解玉米浆/生淀粉中的蛋白质，释放更多FAN和氨基酸，促进酵母生长和活细胞数，降低培养基粘度，缩短发酵时间并显著提高乙醇产量，在VHG生淀粉乙醇生产中具有工业应用价值。