Direct biocatalytic one-pot-transformation of cyclohexanol with molecular oxygen into ε-caprolactone
- 作者
- Svenja Staudt, Uwe T. Bornscheuer, Ulf Menyes, Werner Hummel, Harald Gröger
- 单位
- Department of Chemistry and Pharmacy, University of Erlangen-Nürnberg; Department of Biotechnology & Enzyme Catalysis, Institute of Biochemistry; Enzymicals AG; Institute of Molecular Enzyme Technology at the Heinrich-Heine-University of Düsseldorf, Research Centre Jülich; Faculty of Chemistry, Bielefeld University
- 杂志
- Enzyme and Microbial Technology（2013）
- DOI
- 10.1016/j.enzmictec.2013.03.011
- 所属领域
- 生物催化
- 关键词
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解决的核心问题
如何利用廉价易得的环己醇为原料、仅以空气为氧化剂，通过一锅双酶催化反应直接合成ε-己内酯，并解决高底物浓度下转化率显著下降的问题。
研究策略
将醇脱氢酶（ADH）催化的环己醇氧化与Baeyer-Villiger单加氧酶（BVMO）催化的环己酮氧化偶联，构成级联反应，仅需空气（分子氧）和催化量的NADP+，实现原位辅因子再生，避免额外有机辅底物。
研究路线图
核心内容
该研究构建了一种无需额外有机辅底物的一锅双酶级联反应，以廉价环己醇为原料、空气为唯一氧化剂直接合成ε-己内酯。体系由乳酸克菲尔乳杆菌的醇脱氢酶催化环己醇氧化为环己酮，再经乙酸钙不动杆菌的Baeyer-Villiger单加氧酶氧化为ε-己内酯，催化量NADP+实现原位辅因子再生。在底物浓度20、40、60 mM时，ε-己内酯转化率分别达97%、97%和94%，60 mM时产物浓度达6.45 g/L；但浓度升至80和100 mM时转化率骤降至36%和24%。酶稳定性实验揭示，环己醇和环己酮在100 mM和50 mM时均使BVMO剩余活性降至40%以下，而产物ε-己内酯抑制更为显著：0.25 M时24小时几乎完全失活，0.4 M以上初始即无活性。结果表明，高底物浓度下转化率下降主要源于产物和底物对BVMO的抑制失活，而非辅因子限制。该一锅法为绿色合成己内酯提供了可行路径，但需通过蛋白工程或原位产物去除来缓解产物抑制，并优化NADPH浓度以实现更高底物负荷。
创新点
首次实现了从环己醇到ε-己内酯的直接生物催化一锅法双氧化，仅以空气为唯一氧化剂，无需额外有机辅底物；系统研究了底物、中间体及产物对BVMO的抑制和稳定性影响。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli (重组表达宿主) | 环己醇→环己酮→ε-己内酯双氧化途径 | — | 醇脱氢酶来自乳酸克菲尔乳杆菌 (LK-ADH) | 催化 | 催化环己醇氧化为环己酮，同时将NADP+还原为NADPH |
| Escherichia coli (重组表达宿主) | 环己醇→环己酮→ε-己内酯双氧化途径 | — | Baeyer-Villiger单加氧酶来自乙酸钙不动杆菌 (ECS-MO-1) | 催化 | 催化环己酮氧化为ε-己内酯，需要分子氧和NADPH |
关键发现
- 在底物浓度20、40、60 mM时，ε-己内酯转化率分别为97%、97%、94%，60 mM时产物浓度达6.45 g/L
- 80 mM时转化率降至36%，100 mM时仅24%（产物浓度2.72 g/L）。BVMO稳定性实验显示：无添加剂24 h后剩余活性60%
- 环己醇100 mM时剩余活性低于40%
- 环己酮50 mM时剩余活性低于40%，100 mM时降至21%。产物抑制实验表明：ε-己内酯0.1 M时剩余活性低于70%，0.4 M时活性极低
- 稳定性实验中，0.25 M ε-己内酯24 h后几乎完全失活，0.5 M和1.0 M时初始即无活性。
研究结论
该生物催化一锅法可在环己醇20-60 mM条件下实现94-97%的高转化率合成ε-己内酯，但高底物浓度下转化率下降归因于产物ε-己内酯对BVMO的显著抑制和部分失活，以及环己醇和环己酮的抑制。未来需通过蛋白工程或原位产物去除策略改善，并优化NADPH浓度和过程开发。