An ene reductase from Clavispora lusitaniae for asymmetric reduction of activated alkenes
- 作者
- Yan Ni, Hui-Lei Yu, Guo-Qiang Lin, Jian-He Xu
- 单位
- State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China; Shanghai Institute of Organic Chemistry, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200032, China
- 杂志
- Enzyme and Microbial Technology（2014）
- DOI
- 10.1016/j.enzmictec.2013.12.016
- 所属领域
- 生物催化
- 关键词
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解决的核心问题
已知烯还原酶（ERs）反应速率低、总转化数（TTN）不高，限制了其在制备级不对称还原活化烯烃中的应用，亟需发现新的高效、高立体选择性烯还原酶。
研究策略
基于序列同源性从Clavispora lusitaniae基因组中挖掘出假定的烯还原酶基因CIER，在大肠杆菌中异源表达、纯化并系统表征其酶学性质；以葡萄糖脱氢酶（GDH）进行NADPH循环再生，实现高浓度底物酮异佛尔酮的高效不对称还原。
研究路线图
核心内容
本研究从Clavispora lusitaniae基因组中基于序列同源性挖掘到一新的烯还原酶基因CIER，并在大肠杆菌BL21(DE3)中实现异源表达与纯化。酶学表征显示CIER为NADPH依赖的含FMN黄素蛋白，以二聚体形式存在，亚基约45 kDa，最适pH 6.0–6.5、最适温度40 °C，在30 °C下半衰期达495小时，表现出良好的操作稳定性。该酶对多种活化烯烃（烯酮、烯醛、马来酰亚胺及α,β-不饱和二羧酸酯）均具还原活性，产物对映体过量最高超过99%；其中对酮异佛尔酮的比活力达7.3 U/mg，对2-甲基肉桂醛的催化效率kcat/Km高达810 s⁻¹ mM⁻¹。在葡萄糖脱氢酶（GDH）偶联的NADPH循环再生体系中，CIER可在500 mM底物浓度下于1小时内将酮异佛尔酮还原为(R)-levodione，转化率97%、光学纯度98% ee、分离收率80%，总转化数约30,000，时空产率达60 g L⁻¹ h⁻¹。该结果展示了CIER在制备级不对称还原活化烯烃中的高效性与实用性，为手性化合物合成提供了新的高活性酶催化剂。
创新点
发现了一个新的来自Clavispora lusitaniae的烯还原酶CIER，具有高比活力和催化效率，对酮异佛尔酮比活力达7.3 U/mg，对2-甲基肉桂醛的催化效率kcat/Km达810 s⁻¹ mM⁻¹；首次展示了在500mM底物浓度下，1小时内以97%产率和98% ee合成(R)-levodione的能力，TTN约30000，产率达60 g L⁻¹ h⁻¹。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Clavispora lusitaniae (CGMCC 2.1597) | 烯还原（来源菌） | 烯还原酶基因（GenBank Accession No. XM_002615435） | CIER | 催化 | 目标基因来源菌 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 异源表达 | 烯还原酶基因（同源序列） | CIER | 催化 | 异源表达宿主，用于重组蛋白表达与纯化 |
| Bacillus subtilis | 葡萄糖代谢/辅因子再生 | — | 葡萄糖脱氢酶（GDH） | 能量供给 | 用于NADPH循环再生，驱动不对称还原反应 |
关键发现
- CIER为NADPH依赖的含FMN黄素蛋白，二聚体结构（亚基45kDa，天然分子量79kDa）
- 最适pH 6.0-6.5，最适温度40°C，30°C/40°C/50°C半衰期分别为495h/36h/6min
- 对多种活化烯烃（烯酮、烯醛、马来酰亚胺衍生物、α,β-不饱和二羧酸酯）具有还原活性，产物ee最高>99%
- 对酮异佛尔酮比活力7.3 U/mg，对(R)-香芹酮比活力2.2 U/mg
- 2-甲基环戊烯酮还原>99%转化、93% ee（S），3-甲基环戊烯酮仅28%转化但>99% ee（S）
- 500mM酮异佛尔酮在1h内转化为(R)-levodione，转化率97%，光学纯度98% ee，分离收率80%。
研究结论
CIER是一种合成有用的高效烯还原酶，尤其适用于不对称还原活化烯烃制备(R)-levodione等手性化合物，具有高活性、高立体选择性和良好的操作稳定性。