Production of rubusoside from stevioside by using a thermostable lactase from Thermus thermophilus and solubility enhancement of liquiritin and teniposide
- 作者
- Thi Thanh Hanh Nguyen, Seung-Jin Jung, Hee-Kyoung Kang, Young-Min Kim, Young-Hwan Moon, Misook Kim, Doman Kim
- 单位
- Institutes of Green Bio Science & Technology, Seoul National University; Korea Atomic Energy Research Institute Advanced Radiation Technology Institute; Research Center for Proteineaceous Materials (RCPM), Chosun University; Infection Control Material Research Center, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology; Audubon Sugar Institute, Louisiana State University Agricultural Center; Department of Food Science and Nutrition, Dankook University; Department of Agricultural Biotechnology, Seoul National University
- 杂志
- Enzyme and Microbial Technology（2014）
- DOI
- 10.1016/j.enzmictec.2014.07.001
- 所属领域
- 生物催化/酶工程
- 关键词
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解决的核心问题
高效酶法将甜菊苷（stevioside）转化为甜茶苷（rubusoside），并利用甜茶苷提高难溶性药物（甘草苷和替尼泊苷）的水溶性，以解决药物口服吸收差和生物利用度低的问题。
研究策略
从31种水解酶中筛选能选择性水解甜菊苷C13位β-1,2-糖苷键的酶，发现嗜热栖热菌（Thermus thermophilus）的重组乳糖酶（β-GLYPI）转化效率最高；将该酶固定化于海藻酸钠凝胶珠上，用于多批次生产甜茶苷；随后用制备的甜茶苷与甘草苷、替尼泊苷复配，测定其增溶效果。
核心内容
该研究从31种水解酶中筛选出嗜热栖热菌来源的重组乳糖酶rβ-GLYPI，可选择性水解甜菊苷C13位β-1,2-糖苷键生成甜茶苷。该酶经Ni-NTA纯化后比活力达66.8 U/mg，在0.5%甜菊苷底物下实现98%转化率和92%理论产率。将酶固定化于海藻酸钠凝胶珠后可重复使用12次，平均水解率保持95.4%，每循环甜茶苷产量4.91 g/L。在200 g/L甜菊苷和1200 U酶的优化条件下，9小时合成产率最高达86%，单位酶产率较文献报道的曲霉β-半乳糖苷酶提高23.2至56.8倍。制备的甜茶苷能显著增强难溶性药物溶解度：10%甜茶苷溶液使甘草苷水溶性从0.98 mg/mL提升至4.70 mg/mL，使替尼泊苷从0增至3.42 mg/mL。这些结果表明该热稳定乳糖酶兼具高选择性和高转化效率，固定化策略适合工业化生产甜茶苷，获得的甜茶苷可作为药物增溶剂改善口服制剂生物利用度，为酶法糖基改造与药物递送提供了可行结合路径。
创新点
首次报道Thermus thermophilus的乳糖酶可将甜菊苷高效转化为甜茶苷；固定化酶可重复使用12次，Ste水解率保持95.4%，Ru产量稳定；甜茶苷使甘草苷和替尼泊苷的水溶性分别提高约4.8倍和从0增至3.42 mg/mL。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3)pLysS | 甜菊苷→甜茶苷（选择性水解β-1,2-葡萄糖苷键） | β-glypi | 重组乳糖酶（β-GLYPI） | 催化 | 重组表达宿主；该酶源自Thermus thermophilus，用于转化甜菊苷（Ste）生成甜茶苷（Ru） |
| Thermus thermophilus | — | β-glypi（编码基因） | β-半乳糖苷酶/乳糖酶（β-GLY） | 催化 | 原始酶来源，GenBank Accession No. AY130254.1 |
| Aspergillus niger | 甜菊苷水解 | — | 果胶酶/β-半乳糖苷酶（Sumizyme SPC、Sumilact L、Validase AGS） | 催化 | 商业酶制剂，筛选时也表现出将Ste转化为Ru的活性，但效率低于重组乳糖酶 |
| Penicillium spp. | 甜菊苷水解 | — | 柚苷酶（Cellulase Kn，含α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶活性） | 催化 | 商业酶制剂，筛选时可将Ste转化为Ru，转化率52% |
| Rubus suavissimus (Chinese sweet tea) | 甜茶苷（Ru）天然合成 | — | — | 区室化 | 甜茶苷的天然来源植物，但在本研究中作为产物目标，非实验对象 |
关键发现
- 重组乳糖酶（rβ-GLYPI）在E. coli中表达后，经Ni-NTA纯化，比活力为66.8 U/mg，纯化12.4倍，回收率56.7%
- 以0.5% Ste为底物筛选时，该酶实现98%的Ste转化率和92%的理论Ru产率
- 固定化酶（海藻酸钠珠）重复12个反应循环，平均Ste水解率95.4%，每循环Ru产量为4.91 g/L（摘要中亦提到49 g/L，可能为批量合计）
- 在200 g/L Ste和1200 U乳糖酶条件下，9 h反应Ru合成产率最高达86%，单位酶产率（每1000 U/h）为10.8 g/L
- 与文献中Aspergillus sp. β-半乳糖苷酶相比，本酶的单位酶产率提高23.2~56.8倍
- 10% Ru溶液将甘草苷水溶性从0.98 mg/mL提高至4.70±0.12 mg/mL，将替尼泊苷水溶性从0提高至3.42±0.11 mg/mL。
研究结论
嗜热栖热菌重组乳糖酶可高效、特异地催化甜菊苷生成甜茶苷，固定化酶技术使该过程可重复、热稳定、成本低，适合工业化生产；所制备的甜茶苷能显著增强甘草苷和替尼泊苷的水溶性，为改善难溶性药物的剂型设计提供了新途径。