Improvement of catalytical properties of two invertases highly tolerant to sucrose after expression in Pichia pastoris. Effect of glycosylation on enzyme properties
- 作者
- Ara Itzel Pérez de los Santos, Maribel Cayetano-Cruz, Marina Gutiérrez-Antón, Alejandro Santiago-Hernández, Miguel Plascencia-Espinosa, Amelia Farrés, María Eugenia Hidalgo-Lara
- 单位
- Departamento de Biotecnología y Bioingeniería, CINVESTAV-IPN. Av. Instituto Politécnico Nacional No. 2508, D.F. CP 07360, México; Centro de Investigación en Biotecnología Aplicada - IPN, Km 1.5 Carretera Estatal Tecuexcomac-Tepetitla, 90700, Tepetitla, Tlaxcala, México; Departamento of Alimentos y Biotecnología, Facultad de Química, UNAM. C.P. 04510, Mexico, D.F. México
- 杂志
- Enzyme and Microbial Technology（2016）
- DOI
- 10.1016/j.enzmictec.2015.11.008
- 所属领域
- 酶工程
- 关键词
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解决的核心问题
天然状态下Zymomonas mobilis的蔗糖转化酶INVA和INVB表达水平低，限制了工业应用；本研究通过毕赤酵母异源表达提高产量，并阐明糖基化对酶催化性能的影响。
研究策略
将Z. mobilis的invA和invB基因克隆到pPICZαB载体，在毕赤酵母X-33中由AOX1启动子驱动表达；对重组酶INVA_AOX1和INVB_AOX1进行纯化、去糖基化处理，系统比较其pH、温度、动力学、热稳定性及蔗糖耐受性。
核心内容
针对运动发酵单胞菌来源的高耐蔗糖转化酶INVA和INVB在天然宿主中表达量低的问题，本研究将invA和invB基因克隆至pPICZαB载体并在毕赤酵母X-33中由AOX1启动子异源表达，纯化后系统比较了重组酶与去糖基化酶的酶学性质。结果显示，重组INVA_AOX1和INVB_AOX1的比活力分别达1660和1993 U/mg，较天然酶提高约9倍和7倍，催化效率提升2至200倍，其中INVA_AOX1的kcat/KM达296 s⁻¹mM⁻¹。糖基化对酶性能至关重要：去糖基化后，INVA_AOX1的热稳定性在35℃和45℃分别下降1.8和1.6倍，蔗糖耐受浓度从400 mM降至300 mM，而商业酿酒酵母转化酶在150 mM即受抑制。此外，1 mM Mn²⁺可使INVA_AOX1活性提高80%。这些结果表明，毕赤酵母表达不仅大幅提高了产量，且糖基化修饰显著增强了酶的热稳定性、催化效率和蔗糖耐受性，使重组酶具备在甘蔗糖蜜高蔗糖环境下发酵产乙醇的工业应用潜力。
创新点
首次在毕赤酵母中表达来自Z. mobilis的高耐蔗糖转化酶INVA和INVB并研究糖基化效应；发现糖基化可使酶热稳定性、催化效率和蔗糖耐受性显著提升，其中INVA_AOX1的催化效率比天然酶提高约500倍。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Pichia pastoris X-33 | 蔗糖代谢 | invA | INVA_AOX1 | 催化 | 重组胞内转化酶，糖含量19%，比活性1660 U/mg |
| Pichia pastoris X-33 | 蔗糖代谢 | invB | INVB_AOX1 | 催化 | 重组胞外转化酶，糖含量4%，比活性1993 U/mg |
| Zymomonas mobilis CDBB-B603 | 蔗糖代谢 | invA | INVA | 催化 | 天然胞内转化酶，比活性139 U/mg |
| Zymomonas mobilis CDBB-B603 | 蔗糖代谢 | invB | INVB | 催化 | 天然胞外转化酶，比活性317 U/mg |
| Pichia pastoris X-33 | 甲醇诱导表达系统 | AOX1启动子 | — | 调控 | 用于驱动invA和invB异源表达 |
关键发现
- 纯化后INVA_AOX1和INVB_AOX1比活性分别为1660 U/mg和1993 U/mg，比天然酶分别高9倍和7倍
- 重组酶的底物亲和力比天然酶高2-3倍，催化效率高2-200倍
- INVA_AOX1的kcat/KM为296 s^-1 mM^-1，d-INVA_AOX1为107 s^-1 mM^-1，d-INVA_AOX1比糖基化形式低1.3倍
- INVB_AOX1为208 s^-1 mM^-1，d-INVB为164 s^-1 mM^-1
- 去糖基化后热稳定性下降：INVA_AOX1在35°C和45°C半衰期分别为900和480 min，d-INVA_AOX1低1.8和1.6倍
- INVB_AOX1在35°C和40°C半衰期分别为80和50 min，d-INVB低1.3和5倍
- Mn^2+可使INVA_AOX1和INVB_AOX1活性分别提高80%（1 mM）和20%（5 mM）
- INVA_AOX1和INVB_AOX1分别在蔗糖浓度400 mM和300 mM时保持高活性，去糖基化后d-INVA_AOX1的耐受浓度降至300 mM，而商业酿酒酵母转化酶在150 mM即被抑制
- 糖含量方面，INVA_AOX1为19%，INVB_AOX1为4%，分子量分别为68和48 kDa，去糖基化后为57和46 kDa。
研究结论
通过毕赤酵母AOX1启动子异源表达，成功获得产量和催化性能显著提高的INVA_AOX1和INVB_AOX1转化酶；糖基化在提升酶热稳定性、催化效率和蔗糖耐受性中发挥关键作用，这些重组酶有望用于甘蔗糖蜜发酵生产乙醇等工业过程。