Characterization of two styrene monooxygenases from marine microbes
- 作者
- Wei Pu, Can Cui, Chao Guo, Zhong-Liu Wu
- 单位
- 中国科学院成都生物研究所；四川省环境微生物重点实验室；中国科学院大学
- 杂志
- 酶与微生物技术（2018）
- DOI
- 10.1016/j.enzmictec.2018.02.001
- 所属领域
- 酶工程
- 关键词
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解决的核心问题
已有的苯乙烯单加氧酶(SMO)来源有限，主要来自假单胞菌和红球菌，缺乏来自海洋微生物的SMO，需要挖掘新酶以扩大酶工具箱。
研究策略
采用基因组挖掘方法，从海洋细菌Paragalicecola agarlytica NO2和Marinobacterium litorale DSM 23545的基因组中鉴定两个双组分SMO基因，密码子优化后在大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达，用全细胞催化评价其环氧化和硫氧化活性及立体选择性，并与已知的Pseudomonas SMO比较。
核心内容
针对已有苯乙烯单加氧酶来源有限的问题，本研究采用基因组挖掘策略，从海洋细菌Paragalicecola agarlytica NO2和Marinobacterium litorale DSM 23545中鉴定出两个双组分苯乙烯单加氧酶基因PaSMO和MiSMO，经密码子优化后在大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达，并以全细胞催化评价其环氧化和硫氧化活性及立体选择性。两个酶的最适反应条件均为30°C和pH 8.0，在此条件下MiSMO的活性分别是PaSMO的2.0倍（温度）和2.5倍（pH），且MiSMO在40°C仍保留超过80%的最大活性。与已知假单胞菌来源的PsSMO相比，MiSMO对苯乙烯、肉桂醇和4-乙烯基-2,3-二氢苯并呋喃的转化率分别提高3.0、3.4和2.6倍，且对共轭芳香烯烃均保持大于99%对映选择性的(S)-环氧化物产物。该工作首次报道了海洋微生物来源的苯乙烯单加氧酶，其中MiSMO在活性和热稳定性上均优于已有酶，为芳香烯烃不对称环氧化提供了新的高效生物催化剂，拓展了苯乙烯单加氧酶的酶工具箱。
创新点
首次报道海洋微生物来源的苯乙烯单加氧酶；其中MiSMO对共轭芳香烯烃表现出显著提高的转化率，并保持>99% ee的立体选择性。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | — | — | — | — | 异源表达宿主菌 |
| — | 苯乙烯降解途径 | paStyA | PaStyA | 催化 | 来自Paragalicecola agarlytica NO2，FAD依赖的苯乙烯环氧化酶，催化环氧化和硫氧化 |
| — | 苯乙烯降解途径 | paStyB | PaStyB | 能量供给 | 来自Paragalicecola agarlytica NO2，NADH依赖的黄素还原酶，为PaStyA提供还原型FAD |
| — | 苯乙烯降解途径 | miStyA | MiStyA | 催化 | 来自Marinobacterium litorale DSM 23545，FAD依赖的苯乙烯环氧化酶，催化环氧化和硫氧化 |
| — | 苯乙烯降解途径 | miStyB | MiStyB | 能量供给 | 来自Marinobacterium litorale DSM 23545，NADH依赖的黄素还原酶，为MiStyA提供还原型FAD |
| — | 苯乙烯降解途径 | styA (PsSMO) | PsStyA | 催化 | 来自Pseudomonas sp. LQ26，作为对照的苯乙烯环氧化酶 |
| — | 苯乙烯降解途径 | styB (PsSMO) | PsStyB | 能量供给 | 来自Pseudomonas sp. LQ26，NADH依赖的黄素还原酶 |
关键发现
- 两个SMO（PaSMO和MiSMO）最适反应条件均为30°C和pH
- 0；最大活性时MiSMO是PaSMO的2.0倍（温度）和2.5倍（pH）；在pH
- 0时，Tris-HCl缓冲液使MiSMO和PaSMO活性分别下降29.4%和18.1%；MiSMO在40°C保留>80%最大活性，而PaSMO保留50%；与PsSMO相比，MiSMO对苯乙烯(1a)、肉桂醇(2a)和4-乙烯基-2,3-二氢苯并呋喃(6a)的转化率分别提高3.0、3.4和2.6倍；对底物1a、2a、3a和6a，三个SMO均给出>99% ee的(S)-环氧化物；对底物4a的ee为67-83%，对硫醚5a的ee为19-42%。
研究结论
从海洋微生物中成功鉴定并功能性表达了两个双组分苯乙烯单加氧酶PaSMO和MiSMO，全细胞催化剂能高效催化多种芳香烯烃的不对称环氧化和硫氧化反应；其中MiSMO对共轭烯烃（如苯乙烯、肉桂醇和4-乙烯基-2,3-二氢苯并呋喃）的活性显著高于已知的假单胞菌SMO，且保持优异立体选择性，具有生物催化应用潜力。