Elucidation of the β-carotene hydroxylation pathway in Arabidopsis thaliana
- 作者
- Alessia Fiore, Luca Dall'Osto, Paul D. Fraser, Roberto Bassi, Giovanni Giuliano
- 单位
- Ente per le Nuove tecnologie, l'Energia e l'Ambiente (ENEA), Dipartimento Biotecnologie, Centro Ricerche Casaccia, Roma, Italy; Dipartimento Scientifico e Tecnologico, Università di Verona, Verona, Italy; Laboratoire de Génétique et Biophysique des Plantes, Université de la Méditerranée, Marseille, France; School of Biological Sciences, Royal Holloway, University of London, Egham, Surrey, UK
- 杂志
- FEBS Letters（2006）
- DOI
- 10.1016/j.febslet.2006.07.055
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
拟南芥中β-胡萝卜素羟化途径尚未完全阐明，缺乏完全阻断α-或β-胡萝卜素羟化的突变体，需要确定参与β-环羟化的酶及其在α-与β-胡萝卜素羟化中的分工。
研究策略
通过构建CHY1、CHY2、LUT1、LUT5、LUT2基因的T-DNA插入双突变和三突变组合，结合HPLC和MALDI-TOF分析叶类胡萝卜素组成，解析各羟化酶的体内功能和底物偏好。
核心内容
该研究通过构建拟南芥CHY1、CHY2、LUT1、LUT5和LUT2基因的T-DNA插入双突变及三突变组合，结合HPLC与MALDI-TOF分析，系统解析了β-胡萝卜素羟化途径中各酶的体内功能与底物偏好。结果显示，chy1chy2lut5三突变体中β-胡萝卜素来源的叶黄素完全检测不到（检测限为野生型水平的3%），表明超过97%的β-胡萝卜素羟化被消除，首次实现了该途径的完全阻断；而该突变体仍积累高水平叶黄素（8.1 mol/100 mol Chl），证明存在额外β-环羟化酶活性。chy1chy2lut2三突变体中约80%叶片类胡萝卜素为β-胡萝卜素，lut5单突变体积累α-胡萝卜素达8.7 mol/100 mol Chl。研究证实LUT5是β-胡萝卜素β-环羟化的主要酶，CHY1、CHY2与LUT5共同承担超过97%的羟化活性；α-胡萝卜素的β-环可被LUT5及未知酶催化，其ε-环羟化由LUT1完成，且LUT1偏好玉米黄质而非α-胡萝卜素。这明确了拟南芥类胡萝卜素羟化途径的分工机制，为代谢工程改造类胡萝卜素组成提供了靶点。
创新点
首次在chy1chy2lut5三突变体中完全消除β-胡萝卜素羟化；证明LUT5主要参与β-环羟化且对α-胡萝卜素的β-环有活性；发现至少存在一个能羟化α-胡萝卜素β-环但不能羟化β-胡萝卜素β-环的额外羟化酶。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Arabidopsis thaliana | 类胡萝卜素生物合成途径 | CHY1 | CHY1（β-胡萝卜素羟化酶，铁氧还蛋白依赖性双铁加氧酶） | 催化 | 非血红素羟化酶，参与β-环羟化；T-DNA插入突变体SAIL 49A07 |
| Arabidopsis thaliana | 类胡萝卜素生物合成途径 | CHY2 | CHY2（β-胡萝卜素羟化酶，铁氧还蛋白依赖性双铁加氧酶） | 催化 | 非血红素羟化酶，参与β-环羟化；T-DNA插入突变体SAIL 1242B12 |
| Arabidopsis thaliana | 类胡萝卜素生物合成途径 | LUT1 | LUT1/CYP97C1（ε-环羟化酶，细胞色素P450） | 催化 | 负责ε-环羟化，底物偏好为玉米黄质；T-DNA插入突变体Salk 129724 |
| Arabidopsis thaliana | 类胡萝卜素生物合成途径 | LUT5 | LUT5/CYP97A3（β-环羟化酶，细胞色素P450） | 催化 | 体内主要羟化α-胡萝卜素的β-环，对β-胡萝卜素的β-环也有活性；T-DNA插入突变体Salk 116660 |
| Arabidopsis thaliana | 类胡萝卜素生物合成途径 | LUT2 | LUT2（番茄红素ε-环化酶） | 催化 | 催化番茄红素ε-环的环化，影响α-胡萝卜素合成；T-DNA插入突变体Salk 005018 |
关键发现
- 在chy1chy2lut2三突变体中，约80%的叶片类胡萝卜素为β-胡萝卜素（暗适应下β-胡萝卜素为22.3 mol/100 mol Chl，总类胡萝卜素约27.7）。在chy1chy2lut5三突变体中，β-胡萝卜素来源的叶黄素（紫黄质、新黄质、玉米黄质等）完全检测不到，检测限为野生型水平的3%，表明超过97%的β-胡萝卜素羟化被消除
- 该突变体仍含有高水平叶黄素（8.1 mol/100 mol Chl），证明存在额外的β-环羟化酶活性。lut5单突变体积累α-胡萝卜素达8.7 mol/100 mol Chl（暗适应），MALDI-TOF确认其m/z为536.34，对应C40H56。
研究结论
在拟南芥中，LUT5在β-胡萝卜素的β-环羟化中起主要作用，而CHY1、CHY2和LUT5共同承担超过97%的β-胡萝卜素羟化；α-胡萝卜素的β-环可被多种羟化酶（包括LUT5及一个未知酶）催化，其ε-环羟化由LUT1完成，且LUT1的底物偏好是玉米黄质而非α-胡萝卜素。