Artemisia annua L. (Asteraceae) trichome-specific cDNAs reveal CYP71AV1, a cytochrome P450 with a key role in the biosynthesis of the antimalarial sesquiterpene lactone artemisinin
- 作者
- Keat H. Teoh, Devin R. Polichuk, Darwin W. Reed, Goska Nowak, Patrick S. Covello
- 单位
- Plant Biotechnology Institute, 110 Gymnasium Place, Saskatoon, Sask., Canada S7N OW9
- 杂志
- FEBS Letters（2006）
- DOI
- 10.1016/j.febslet.2006.01.065
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
阐明青蒿素生物合成中关键氧化步骤的酶学基础，特别是催化amorpha-4,11-diene氧化的细胞色素P450酶。
研究策略
利用青蒿腺毛cDNA文库和EST测序，结合酿酒酵母异源表达与体外酶活分析，鉴定并功能表征CYP71AV1。
核心内容
该研究通过构建青蒿腺毛cDNA文库并进行EST测序，结合酿酒酵母异源表达与体外酶活分析，鉴定并功能表征了青蒿素生物合成途径中的关键细胞色素P450酶CYP71AV1。研究发现，CYP71AV1编码488个氨基酸，与CYP71D4和CYP71D16分别具有51%和49%的序列同一性。在酵母WAT11菌株中异源表达后，其微粒体能够以NADPH依赖方式将amorpha-4,11-diene连续氧化为artemisinic alcohol、artemisinic aldehyde和artemisinic acid，而对该途径其他可能的单萜和倍半萜底物无催化活性，表明其具有严格的底物特异性和多功能氧化能力。EST频率分析显示，amorpha-4,11-diene synthase基因在腺毛文库中占3.9%，而CYP相关EST占比仅为0.3%至1.2%，暗示氧化步骤可能是途径中的限速环节。该工作首次克隆并表征了催化青蒿素前体氧化的关键P450酶，为利用合成生物学手段在异源宿主中重构青蒿素生物合成途径提供了重要的基因元件和改造靶点。
创新点
首次克隆并表征了CYP71AV1，证明其是一种多功能细胞色素P450单加氧酶，可连续催化amorpha-4,11-diene氧化为artemisinic alcohol、artemisinic aldehyde和artemisinic acid。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Artemisia annua | 青蒿素生物合成途径 | CYP71AV1 | CYP71AV1（细胞色素P450单加氧酶） | 催化 | 催化amorpha-4,11-diene依次氧化为artemisinic alcohol、artemisinic aldehyde和artemisinic acid |
| Saccharomyces cerevisiae (WAT11) | 异源表达系统 | CYP71AV1 | CYP71AV1（细胞色素P450单加氧酶） | 催化 | 用于体外酶活表征，微粒体组分具有NADPH依赖的多步氧化活性 |
关键发现
- CYP71AV1在酵母中异源表达后，其微粒体能够以NADPH依赖方式将amorpha-4,11-diene羟化为artemisinic alcohol（GC/MS保留时间16.6 min），并进一步氧化为artemisinic aldehyde和artemisinic acid
- 对青蒿素生物合成其他可能的底物（如柠檬烯、蒎烯等单萜及多种倍半萜）无活性。EST频率分析显示，amorpha-4,11-diene synthase基因在GSTSUB和AAGST文库中分别占3.9%和0.9%，而在花蕾文库中缺失
- CYP相关EST在GSTSUB、AAGST和AAFB文库中分别占0.3%、1.2%和0.1%。CYP71AV1编码488个氨基酸，与CYP71D4有51%同一性，与CYP71D16有49%同一性。
研究结论
CYP71AV1是青蒿素生物合成途径中催化amorpha-4,11-diene氧化步骤的关键酶，其多功能氧化活性为工程化生产青蒿素提供了新的靶点和工具。