Roles of the Skn7 response regulator in stress resistance, cell wall integrity and GA biosynthesis in Ganoderma lucidum
- 作者
- Shengli Wang, Liang Shi, Yanru Hu, Rui Liu, Ang Ren, Jing Zhu, Mingwen Zhao
- 单位
- Key Laboratory of Agricultural Environmental Microbiology, Ministry of Agriculture; Microbiology Department, College of Life Sciences, Nanjing Agricultural University
- 杂志
- Fungal Genetics and Biology（2018）
- DOI
- 10.1016/j.fgb.2018.03.002
- 所属领域
- 代谢工程/合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
灵芝中Skn7响应调节因子在应激抗性、细胞壁完整性和灵芝酸（GA）生物合成中的功能及其调控机制尚未明确，尤其是在大型担子菌中缺乏研究。
研究策略
从灵芝中克隆Skn7同源基因，利用RNA干扰技术构建沉默菌株，通过表型分析、细胞壁组分测定、ROS检测、GA含量分析及关键基因表达分析，系统研究GLSkn7的功能。
研究路线图
核心内容
该研究在大型担子菌灵芝中克隆了Skn7同源基因GLSkn7，并通过RNA干扰技术构建了两个沉默菌株Skn7i-5和Skn7i-7，其表达量分别降低88%和90%。表型分析显示，沉默菌株对氧化胁迫和细胞壁胁迫更加敏感，相对生长抑制率显著增加，同时几丁质含量下降55.8%至51.0%，β-1,3-葡聚糖含量降低45.9%至46.5%，细胞壁厚度减少54.8%至61.9%，表明GLSkn7参与细胞壁完整性维持。进一步检测发现，沉默菌株胞内ROS荧光值升高约1.8倍，H2O2含量上升约75%，而灵芝酸含量提高52.1%至55.9%，关键酶基因hmgr、osc和sqs分别上调约56%、95%和50%。加入ROS清除剂NAC后，ROS和GA含量均恢复至野生型水平，证明GLSkn7通过调控胞内ROS水平进而影响GA生物合成。该研究首次在灵芝中揭示了Skn7响应调节因子通过下调抗氧化基因导致ROS积累，继而激活GA合成关键酶基因表达的功能机制，为理解大型担子菌中双组分信号转导系统与次生代谢调控的关联提供了新线索。
创新点
首次在大型担子菌灵芝中报道Skn7的功能，揭示GLSkn7通过调控胞内ROS水平进而影响GA生物合成的机制，并发现GLSkn7参与细胞壁完整性维持。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Ganoderma lucidum | 双组分信号转导/应激响应 | GLSkn7 | Skn7 response regulator | 调控 | 转录因子，位于双组分信号系统下游，调控抗氧化基因和细胞壁合成基因表达 |
| Ganoderma lucidum | ROS生成（NADPH氧化酶） | noxa, noxb, noxr | NADPH oxidase | 催化 | ROS主要来源，沉默Skn7后其表达无显著变化 |
| Ganoderma lucidum | ROS清除（抗氧化系统） | SOD1, SOD2, SOD4, CAT1, CAT2, GPX, APX, TRR1, TRX2 | 超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶、抗坏血酸过氧化物酶、硫氧还蛋白还原酶、硫氧还蛋白 | 催化 | 沉默Skn7后这些抗氧化酶基因表达显著下调，导致ROS积累 |
| Ganoderma lucidum | 细胞壁几丁质合成 | GL30737, GL31550, GL25613, GL28060, GL30799, GL27969, GL18134, GL15273 | 几丁质合酶 | 催化 | 沉默Skn7后表达下调，几丁质含量降低 |
| Ganoderma lucidum | 细胞壁β-1,3-葡聚糖合成 | GL20535, GL24465, GL24554 | β-1,3-葡聚糖合酶 | 催化 | 沉默Skn7后表达下调，β-1,3-葡聚糖含量降低 |
| Ganoderma lucidum | 灵芝酸（GA）生物合成（甲羟戊酸途径） | hmgr, sqs, osc | 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶、角鲨烯合酶、羊毛固醇合酶 | 催化 | 沉默Skn7后表达上调，GA含量升高；加入NAC后恢复，表明受ROS调控 |
关键发现
- 获得两个沉默菌株Skn7i-5和Skn7i-7，Skn7表达量分别降低88%和90%
- 沉默菌株对氧化胁迫（H2O2、KO2）和细胞壁胁迫（SDS、CR）更敏感，相对生长抑制率增加（H2O2：101%/106%
- KO2：111%/108%
- SDS：54%/53%
- CR：27%/30%）
- 几丁质含量降低55.8%/51.0%，β-1,3-葡聚糖含量降低45.9%/46.5%，细胞壁厚度减少54.8%/61.9%
- 胞内ROS荧光值升高1.78倍/1.82倍，H2O2含量升高73.7%/76.4%
- GA含量升高52.1%/55.9%，关键酶基因hmgr上调56%/52%，osc上调95%/93%，sqs上调49%/53%
- 加入ROS清除剂NAC后，ROS和GA含量均恢复至WT水平，表明GLSkn7通过ROS调控GA生物合成
- 在渗透胁迫、热胁迫和咯菌腈条件下，GLSkn7转录水平上调（1M NaCl:116%，1M KCl:113%，1M Sorbitol:60.7%，1M Mannitol:61.6%，热胁迫:84.7%，咯菌腈:81.3%），且GA含量变化各异。
研究结论
GLSkn7参与灵芝的应激抗性、细胞壁完整性和GA生物合成调控，其通过下调抗氧化基因表达导致ROS积累，进而上调GA生物合成关键酶基因表达，最终促进GA积累。