Synthesis of rebaudioside D, using glycosyltransferase UGTSL2 and in situ UDP-glucose regeneration
- 作者
- Liangliang Chen, Ping Sun, Fangfang Zhou, Yan Li, Kequan Chen, Honghua Jia, Ming Yan, Dachun Gong, Pingkai Ouyang
- 单位
- College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering, Nanjing Tech University, Nanjing 211800, China; Yichang Key Laboratory of Biocatalysis, China Three Gorges University, Yichang 443002, China
- 杂志
- Food Chemistry（2018）
- DOI
- 10.1016/j.foodchem.2018.03.126
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
甜菊叶中瑞鲍迪苷D（Rebaudioside D）含量极低（约0.4-0.5% w/w），且化学合成困难，需要高效的酶法合成方法；同时糖基转移反应需要昂贵的UDP-葡萄糖作为糖基供体，亟需解决辅因子再生问题。
研究策略
将来自番茄的UDP-葡萄糖基转移酶UGTSL2与来自马铃薯的蔗糖合酶StSUS1偶联，建立一锅法级联反应体系，通过蔗糖合酶催化蔗糖和UDP原位再生UDP-葡萄糖，实现从瑞鲍迪苷A到瑞鲍迪苷D的高效酶法转化。
核心内容
针对甜菊叶中瑞鲍迪苷D含量极低且化学合成困难的问题，本研究构建了偶联番茄UDP-葡萄糖基转移酶UGTSL2与马铃薯蔗糖合酶StSUS1的一锅法级联反应体系。该体系利用蔗糖合酶催化蔗糖与UDP原位再生糖基供体UDP-葡萄糖，从而驱动瑞鲍迪苷A高效转化为瑞鲍迪苷D，避免了昂贵辅因子的外源添加。通过系统优化底物比、温度、粗酶浓度及反应时间等参数，在20 g/L瑞鲍迪苷A、60 g/L蔗糖、30°C、pH 7.2及粗酶蛋白9 mg/mL条件下反应20 h，瑞鲍迪苷D产量达17.4 g/L，产率74.6%。研究发现，提高蔗糖比例、反应温度和酶浓度均可显著提升转化效率，且UGTSL2对瑞鲍迪苷D的亲和力（Km=0.29 mM）高于瑞鲍迪苷A（Km=0.89 mM）。此外，延长反应时间会导致瑞鲍迪苷D进一步糖基化生成瑞鲍迪苷M2，需精确控制反应进程。初步实验在10 g/L底物、30 g/L蔗糖及3 mM Mg²⁺条件下反应14 h，产率可达83.3%（9.72 g/L）。该级联策略为低成本、规模化酶法合成高价值甜菊糖苷提供了可行途径。
创新点
['首次将UGTSL2与StSUS1偶联用于瑞鲍迪苷D的酶法合成，实现UDP-葡萄糖原位再生', '系统优化了底物比、温度、粗酶浓度和时间等反应参数，使瑞鲍迪苷D产率达到74.6%', '发现UGTSL2对瑞鲍迪苷D的亲和力高于瑞鲍迪苷A，并能进一步催化瑞鲍迪苷D生成瑞鲍迪苷M2']
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | 甜菊糖苷生物合成（瑞鲍迪苷A→瑞鲍迪苷D） | UGTSL2 | UDP-葡萄糖基转移酶UGTSL2 | 催化 | 来源于番茄（Solanum lycopersicum），催化瑞鲍迪苷A的C-13位糖基化生成瑞鲍迪苷D，并可进一步催化瑞鲍迪苷D生成瑞鲍迪苷M2 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | UDP-葡萄糖再生 | StSUS1 | 蔗糖合酶StSUS1 | 催化 | 来源于马铃薯（Solanum tuberosum），催化蔗糖和UDP生成UDP-葡萄糖和果糖，实现UDP-葡萄糖的原位再生 |
关键发现
- ['在20 g/L瑞鲍迪苷A、60 g/L蔗糖、30°C、pH
- 2、粗酶蛋白9 mg/mL条件下反应20 h，瑞鲍迪苷D产量达17.4 g/L，产率74.6%', '增加蔗糖比例可显著提高产率：底物比1:1时产率仅34.8%（8.1 g/L），1:5时达55.6%（12.9 g/L）', '反应温度从20°C升至40°C，产率从低温下67.7%的瑞鲍迪苷A剩余提升至40°C的58.3%（13.6 g/L）', '粗酶蛋白浓度从3 mg/mL增至9 mg/mL，产率从23.4%（5.5 g/L）提升至62.0%（14.5 g/L）', 'UGTSL2对瑞鲍迪苷A的Km为0.89±0.04 mM，对瑞鲍迪苷D的Km为0.29±0.01 mM；比活力分别为4.62±0.15 mU/mg和16.3±0.09 mU/mg', '延长反应时间至25 h，瑞鲍迪苷D不再积累，而是进一步糖基化生成瑞鲍迪苷M2（LC-MS m/z
- 6）', '初步实验表明，以10 g/L瑞鲍迪苷A、30 g/L蔗糖、3 mM Mg²⁺、粗酶（UGTSL2
- 2 mU/mL，StSUS1
- 7 mU/mL）反应14 h，可合成9.72 g/L瑞鲍迪苷D，产率83.3%']
研究结论
成功建立了SuSy-GT级联反应系统，偶联UGTSL2和StSUS1实现了瑞鲍迪苷D的高效合成及UDP-葡萄糖的原位再生。较高的蔗糖/瑞鲍迪苷A比例、较高反应温度和较高粗酶浓度有利于转化。UGTSL2不仅能将瑞鲍迪苷A转化为瑞鲍迪苷D，还能进一步将其转化为瑞鲍迪苷M2，需控制反应时间以获得瑞鲍迪苷D为主产物。