An electroporation-free method based on Red recombineering for markerless deletion and genomic replacement in the Escherichia coli DH1 genome
- 作者
- Yanlong Wei, Pingping Deng, Ali Mohsin, Yan Yang, Huayan Zhou, Meijin Guo, Hongqing Fang
- 单位
- State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, East China University of Science and Technology; Institute of Health Sciences, Anhui University; Luoyang Vocational & Technical College; Institute of Biotechnology, Academy of Military Medical Sciences
- 杂志
- PLoS ONE（2017）
- DOI
- 10.1371/journal.pone.0186891
- 所属领域
- 代谢工程 / 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
传统 λ-Red 重组依赖电穿孔导入 DNA 片段，效率低且在一些菌株中难以应用；现有免电穿孔方法（如 Gene gorging、Gene Doctoring）存在效率低、残留疤痕或使用重金属等缺陷。本研究旨在建立一种免电穿孔、无标记、可重复的基因组删除与替换方法。
研究策略
利用携带 I-CreI 识别位点的着陆垫质粒 pBDC-Xd/pBDC-Yi，在体内由 I-CreI 内切酶切割释放含同源臂和 cat 抗性盒的靶 DNA 片段，通过 λ-Red 重组整合入 E. coli DH1 染色体；随后用 I-SceI 内切酶切割染色体上的 I-SceI 位点产生 DNA 双链断裂，通过 50 bp 同源序列完成 DSB 修复，实现无标记删除；基因组替换则用含番茄红素表达盒（GC cassette）的供体质粒 pBRIS-GC，在 I-SceI 切割后释放片段并修复染色体缺口。
核心内容
本研究建立了一种基于λ-Red重组且无需电穿孔的E. coli DH1基因组无标记编辑方法。该方法利用携带I-CreI识别位点的着陆垫质粒，在体内由I-CreI内切酶切割释放含同源臂和cat抗性盒的DNA片段，通过λ-Red重组整合入染色体；随后以I-SceI切割产生双链断裂，借助50 bp同源序列完成DSB修复实现无标记删除，整个过程不留疤痕。结果表明，该方法成功删除了DH1基因组中8个非必需区域（2.4–104.4 kb），重组效率较电穿孔法提高10^4–10^7倍。将番茄红素表达盒整合至不同染色体位点后发现，插入位置导致产量约5倍差异，而表达方向导致超过10倍差异，最高产量菌株DH-23rGC达8.36±0.27 mg/L。该工作提供了一种高效、无标记的基因组编辑工具，并揭示了表达方向对染色体整合表达的关键影响，为代谢工程中的基因组优化提供了新思路。
创新点
首次将 I-CreI 内切酶与 sacB 负筛选标记结合，实现无需电穿孔的体内靶 DNA 片段生成；删除过程不留疤痕（无 FLP 或 80 bp scar）；重组效率较电穿孔法提高 10^4-10^7 倍；可直接进行基因组替换而不需额外电穿孔步骤。
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli DH1 | λ-Red 重组 | exo, bet, gam | Exo, Beta, Gam | 催化 | λ-Red 重组系统三蛋白，介导同源重组与 DNA 双链断裂修复 |
| Escherichia coli DH1 | 基因组编辑 | I-CreI | I-CreI 内切酶 | 催化 | 在体内切割着陆垫质粒上的 I-CreI 识别位点，释放靶 DNA 片段 |
| Escherichia coli DH1 | 基因组编辑 | I-SceI | I-SceI 内切酶 | 催化 | 切割染色体上 I-SceI 位点产生 DSB，并切割供体质粒释放 GC 片段 |
| Escherichia coli DH1 | 番茄红素生物合成 | idsA (gps) | Gps (GGPP 合酶) | 催化 | 催化生成牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸 (GGPP) |
| Escherichia coli DH1 | 番茄红素生物合成 | crtB | CrtB (八氢番茄红素合酶) | 催化 | 催化 GGPP 生成八氢番茄红素 |
| Escherichia coli DH1 | 番茄红素生物合成 | crtI | CrtI (八氢番茄红素脱饱和酶) | 催化 | 催化八氢番茄红素脱氢生成番茄红素 |
| Escherichia coli DH1 | 筛选标记 | cat | 氯霉素乙酰转移酶 | 催化 | 赋予氯霉素抗性，用于阳性筛选 |
| Escherichia coli DH1 | 负筛选标记 | sacB | 果聚糖蔗糖酶 | 催化 | 蔗糖存在时表达致死，用于质粒消除的负筛选 |
关键发现
- 成功删除了 E. coli DH1 基因组中 8 个非必需区域（大小
- 4-104.4 kb），选择效率为
- 3%-100%，重组效率为
- 5%-45%，第二步选择效率为
- 6%-94.4%；与电穿孔法（效率约
- 5×10^-6 或
- 9×10^-8）相比，重组效率提高了 10^4-10^7 倍。GC 盒成功整合至第
- 23、58、64 四个非必需区，并构建反向插入菌株 DH-8rGC 和 DH-23rGC。不同插入位点导致番茄红素产量约 5 倍差异，表达方向导致超过 10 倍差异；最高产量菌株 DH-23rGC 产量为
- 36±0.27 mg/L（OD600
- 13±0.88），最低 DH-8GC 为
- 52±0.07 mg/L。
研究结论
本研究建立了一种基于 Red 重组的免电穿孔无标记基因组修饰方法，可高效删除和替换 E. coli 基因组区域，效率显著高于传统电穿孔法；并证明基因表达方向对染色体整合表达的影响大于整合位置，为代谢工程中的基因组优化提供了新工具和指导。