高级醇 · 代谢工程文献库

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Higher-level accumulation of foreign gene products in transgenic rice seeds by the callus-specific selection system

作者
Yuhya Wakasa, Kenjiirou Ozawa, Fumio Takaiva
单位
Transgenic Crop Research and Development Center, National Institute of Agrobiological Sciences; Department of Low-Temperature Sciences, National Agricultural Research Center for Hokkaido Region
杂志
Journal of Bioscience and Bioengineering（2008）
DOI
10.1016/j.jbiosc.2008.09.002
所属领域
代谢工程
关键词
35S promoterAgrobacteriumCallus-specific promoterEndospermOryza sativa L.Selectable markerTransgenic rice
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解决的核心问题

如何在转基因水稻种子中提高外源基因产物的积累水平，同时减少选择标记基因带来的食品安全担忧和组成型表达对产量的负面影响。

研究策略

利用水稻来源的突变乙酰乳酸合酶(mALS)基因在愈伤组织特异性启动子(CSP)控制下作为选择标记，替代组成型CaMV 35S启动子驱动的潮霉素磷酸转移酶(HPT)选择标记，比较不同选择标记体系下乳铁蛋白(lactostatin)在成熟种子中的积累量。

研究路线图

100%
研究问题：如何提高外源基因产物在水稻种子中的积累？同时减少食品安全担忧与产量负面影响
策略：以水稻来源mALS基因在愈伤组织特异性启动子(CSP)控制下作为选择标记，替代组成型CaMV 35S:HPT系统
关键改造：构建3种选择标记体系CSP:mALS、CSP:HPT、35S:HPT，分别与乳铁蛋白(6LacQR/12Lac)共转化水稻低谷蛋白突变体a123
结果：CSP:mALS体系乳铁蛋白积累量为35S:HPT体系的120%~200%（平均1.4倍）；CSP:HPT为35S:HPT的1.62倍；产物占总种子蛋白5%~15%
结论：愈伤组织阶段特异性表达标记基因（CSP:mALS或CSP:HPT）比组成型表达更有效提高外源肽积累，避免代谢负担
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核心内容

该研究以水稻低谷蛋白突变体a123为材料，构建了由愈伤组织特异性启动子（CSP）驱动的水稻内源突变乙酰乳酸合酶（mALS）基因作为选择标记，替代常规的组成型CaMV 35S启动子驱动的潮霉素磷酸转移酶（HPT）选择标记，用于转基因水稻的愈伤组织筛选，并比较了不同选择标记体系下外源乳铁蛋白在成熟种子中的积累水平。结果显示，CSP:mALS体系获得的转基因种子中乳铁蛋白积累量为35S:HPT体系的1.19到2.08倍，平均约1.4倍；CSP:HPT体系亦为35S:HPT体系的1.62倍，转基因产物占种子总蛋白的5%至15%。这表明在愈伤组织选择阶段特异性表达标记基因可有效避免组成型表达带来的代谢负担，从而提高外源活性肽在种子中的积累，同时利用水稻内源基因作标记也降低了食品安全风险。研究为在作物种子中高效积累重组蛋白提供了一种更安全且更优的筛选策略。

创新点

['首次证明愈伤组织特异性表达选择标记基因可提高目标肽在种子中的积累水平', '使用水稻内源mALS作为选择标记，避免细菌源抗性基因的使用，提高安全性']

研究对象（6）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
水稻(Oryza sativa L.)品种'Koshihikari'的低谷蛋白突变体a123 种子贮藏蛋白合成 — — 区室化 宿主细胞，缺乏GluA1/GluA2/GluB4，提供更多存储容量
水稻(Oryza sativa L.)品种'Koshihikari'的低谷蛋白突变体a123 支链氨基酸生物合成 mALS 突变乙酰乳酸合酶 催化 作为选择标记，耐受磺酰脲类除草剂
水稻(Oryza sativa L.)品种'Koshihikari'的低谷蛋白突变体a123 潮霉素抗性 HPT 潮霉素磷酸转移酶 催化 常规选择标记，催化潮霉素磷酸化使其失活
水稻(Oryza sativa L.)品种'Koshihikari'的低谷蛋白突变体a123 — CSP — 调控 愈伤组织特异性启动子，驱动选择标记基因在愈伤组织表达
水稻(Oryza sativa L.)品种'Koshihikari'的低谷蛋白突变体a123 — CaMV 35S — 调控 组成型启动子，用于常规选择标记表达
水稻(Oryza sativa L.)品种'Koshihikari'的低谷蛋白突变体a123 种子贮藏蛋白合成 谷蛋白启动子/编码序列 谷蛋白-乳铁蛋白融合蛋白 区室化 目标产物，在种子内质网/蛋白体中积累

关键发现

  1. 含CSP:mALS的转基因水稻种子中乳铁蛋白积累量为含35S:HPT的约120%-200%（平均约1.4倍），具体：两拷贝6LacQR为1.40倍，三拷贝6LacQR为1.25倍，单拷贝12Lac为2.08倍，双拷贝12Lac为1.19倍
  2. CSP:HPT为35S:HPT的1.62倍
  3. 转基因产物占总种子蛋白的5%-15%
  4. 拷贝数1-6时与表达无显著相关。

研究结论

在愈伤组织选择阶段特异性表达标记基因（CSP:mALS或CSP:HPT）比组成型表达（35S:HPT）能更有效地提高外源生物活性肽在转基因水稻种子中的积累水平，可能因为避免了组成型表达带来的代谢负担或抑制效应。