Ethanol-tolerant Saccharomyces cerevisiae strains isolated under selective conditions by over-expression of a proofreading-deficient DNA polymerase δ
- 作者
- Hiroko Abe, Yasuko Fujita, Yuki Takaoka, Eri Kurita, Shuntaro Yano, Naotaka Tanaka, Ken-ichi Nakayama
- 单位
- Health Technology Research Center, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST); Neo-Morgan Laboratory Inc., Biotechnology Research Center; Department of Life Science, Kagawa University
- 杂志
- Journal of Bioscience and Bioengineering（2009）
- DOI
- 10.1016/j.jbiosc.2009.03.019
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
乙醇对酿酒酵母具有毒性，降低细胞活力和发酵效率，需要获得乙醇耐受性突变菌株并理解其耐受机制，以提高生物乙醇生产效率。
研究策略
基于进化差异理论，利用校对缺陷型DNA聚合酶δ（pol3-01）过表达引入随机突变，在梯度乙醇浓度（5%至11%）条件下筛选乙醇耐受突变株，并通过生理、发酵和基因表达分析表征其特性。
核心内容
本研究通过在酿酒酵母中过表达校对缺陷型DNA聚合酶δ（pol3-01）引入随机突变，并结合5%至11%梯度乙醇浓度进行适应性筛选，成功获得三株乙醇耐受突变体YFY1、YFY2和YFY3。这些突变株可在含13%乙醇的培养基中生长，而野生型W303-1A在10%乙醇下即无法存活；在8%乙醇处理16小时后，YFY3的存活率达58.2%±4.8%，约为野生型的78倍。在25%葡萄糖发酵72小时后，所有YFY菌株的乙醇产量均超过11%（v/v），野生型则未达到该水平。生理与分子分析表明，YFY菌株在正常条件下海藻糖含量较野生型提高2至4倍，胁迫条件下仍高出约3倍，RT-PCR结果证实海藻糖合成相关基因TPS1和TSL1表达上调，而热激蛋白基因HSP12和HSP31表达下调。此外，YFY菌株还表现出耐高温（39°C）、耐盐及耐细胞壁干扰等多重胁迫耐受性。该研究证明基于差异进化理论的诱变策略可有效筛选工业乙醇生产菌株，且海藻糖积累是乙醇耐受性的关键机制。
创新点
['首次将基于差异进化理论的新型诱变技术应用于乙醇耐受菌株的筛选。', '获得三个能在13%乙醇中生长的突变株YFY1、YFY2、YFY3，且在25%葡萄糖发酵中乙醇产量超过11%（v/v）。', '揭示YFY菌株通过上调海藻糖生物合成基因（TPS1、TSL1）积累海藻糖，从而获得乙醇及多重胁迫耐受性。']
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 酿酒酵母W303-1A及其衍生YFY突变株（YFY1、YFY2、YFY3） | — | — | — | 区室化 | 筛选宿主及突变亲本 |
| 酿酒酵母YFY菌株 | DNA复制 | pol3-01 | DNA聚合酶δ（校对缺陷型） | 催化 | 用于引入随机突变的诱变工具 |
| 酿酒酵母YFY菌株 | 海藻糖生物合成 | TPS1 | 海藻糖-6-磷酸合酶 | 催化 | 表达上调，促进海藻糖积累 |
| 酿酒酵母YFY菌株 | 海藻糖生物合成 | TSL1 | 海藻糖-6-磷酸磷酸酶亚基 | 催化 | 表达上调，促进海藻糖积累 |
| 酿酒酵母YFY菌株 | 应激响应 | HSP12 | 热激蛋白12 | 调控 | 正常条件下表达较野生型降低 |
| 酿酒酵母YFY菌株 | 应激响应 | HSP30 | 热激蛋白30 | 调控 | YFY2和YFY3表达水平与野生型相近，YFY1中高表达 |
| 酿酒酵母YFY菌株 | 应激响应 | HSP31 | 热激蛋白31 | 调控 | 正常条件下表达较野生型降低 |
| 酿酒酵母YFY菌株 | 应激响应 | HSP104 | 热激蛋白104 | 调控 | YFY2和YFY3表达水平与野生型相近，YFY1中高表达 |
关键发现
- ['筛选出3株乙醇耐受突变体YFY1、YFY2和YFY3，可在含13%乙醇的培养基中生长，而野生型W303-1A在10%乙醇下不能生长。', '在8%乙醇处理16小时后，YFY3存活率为58.2% ±
- 8%，约为野生型（0.7% ±
- 3%）的78倍。', '在25%葡萄糖发酵培养72小时后，YFY菌株乙醇产量均超过11%（v/v），野生型未达到11%。', 'YFY2和YFY3可在39°C下生长，且所有YFY菌株对Calcofluor white和NaCl的耐受性均高于野生型。', '正常生长条件下，YFY2和YFY3细胞内海藻糖含量比野生型高4倍，YFY1高2倍；在含10%乙醇胁迫下，YFY菌株海藻糖含量比野生型高3倍。', 'RT-PCR显示TPS1和TSL1基因在YFY菌株中表达上调，而HSP12和HSP31表达较野生型降低。']
研究结论
通过过表达校对缺陷型DNA聚合酶δ结合乙醇梯度筛选，成功获得乙醇耐受性显著提高的YFY菌株。其耐受机制主要与海藻糖积累相关，这同时赋予菌株耐高温、耐盐和耐细胞壁干扰等多重胁迫耐受性，使其适用于生物乙醇生产。该诱变策略为工业菌株改良提供了有效途径。