Directed evolution of an aminoalcohol dehydrogenase for efficient production of double chiral aminoalcohols
- 作者
- Nobuyuki Urano, Satoko Fukui, Shoko Kumashiro, Takeru Ishige, Shinji Kita, Keiji Sakamoto, Michihiko Kataoka, Sakayu Shimizu
- 单位
- Division of Applied Life Sciences, Graduate School of Agriculture, Kyoto University, Kitashirakawa-Oiwakecho, Sakyo-ku, Kyoto 606-8502, Japan; Research Institute, Daiichi Fine Chemical Co., 530 Chokejii, Takaoka, Toyama 933-8511, Japan
- 杂志
- Journal of Bioscience and Bioengineering（2010）
- DOI
- 10.1016/j.jbiosc.2010.11.005
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
氨基酸醇脱氢酶（AADH）催化不对称还原生产双手性氨基醇（如dPE）时，受到产物累积的抑制，导致产率受限（约40-50 mg/ml），需要获得对产物耐受性更高的酶突变体。
研究策略
通过易错PCR对aadh基因进行随机突变构建突变体库，利用基于pH指示剂（酚红）的颜色变化高通量筛选方法，筛选在高浓度产物dPE（80 mg/ml）存在下仍具有活性的突变酶，并结合动力学参数分析鉴定关键氨基酸位点。
核心内容
该研究针对氨基酸醇脱氢酶（AADH）在催化合成双手性氨基醇过程中受产物抑制导致产率受限的问题，采用易错PCR对aadh基因进行随机突变，构建了约5000个克隆的突变体库，并开发了基于酚红pH指示剂的颜色变化高通量筛选方法，无需监测NADPH消耗即可直观评估酶在高浓度产物存在下的活性。通过筛选，获得两个单点突变体AADHw1（S214R）和AADHw2（G73S），并进一步构建双突变体AADHm1（G73S/S214R）。动力学分析显示，S214R突变使kcat提高约3.3倍，G73S突变使Km升高约1.3倍，所有突变体的产物抑制常数Ki较野生型（5.7 mM）提高2–3倍，其中双突变体达17.3 mM。在生物转化实验中，野生型在产物约40 mg/ml时停止生产，而AADHm1可产至70.7 mg/ml，摩尔产率87.6%，显著缓解了产物抑制。该研究证明随机突变结合高通量筛选可有效提升酶对产物的耐受性，双突变体在工业生产双手性氨基醇方面具有应用潜力，也为短链脱氢酶还原酶家族的结构-功能关系提供了见解。
创新点
['开发了基于pH指示剂（酚红）的颜色检测高通量筛选方法，无需昂贵NADPH消耗监测，可直观检测反应进程', '获得了两个单点突变体（S214R和G73S）及一个双突变体（G73S/S214R），显著提高了对产物dPE的耐受性', '动力学分析揭示Ser214残基影响酶活性（kcat提高约3倍），Gly73残基参与底物结合（Km升高），为SDR家族结构-功能关系提供见解']
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Rhodococcus erythropolis MAK154 | 氨基醇不对称还原途径 | aadh | AADH（氨基醇脱氢酶，野生型） | 催化 | 催化(S)-1-苯基-1-酮-2-甲氨基丙烷还原生成dPE，受产物dPE抑制，本研究改造对象 |
| Bacillus megaterium | NADPH再生系统 | gdh | GDH（葡萄糖脱氢酶） | 能量供给 | 催化葡萄糖氧化生成葡萄糖酸，同时再生NADPH，为AADH还原反应提供还原力 |
| Escherichia coli JM109 | 氨基醇不对称还原途径（全细胞催化） | aadh（野生型及突变体）, gdh | AADH（野生型/突变体）, GDH | 催化 | 共表达AADH和GDH的重组E. coli，用于筛选及dPE/EPE生产；AADHm1表达菌在100 mg/ml dPE下仍有活性 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 蛋白表达与纯化 | aadh（野生型及突变体） | AADH（His标签融合） | 催化 | 用于过量表达并纯化野生型及突变体AADH，进行动力学参数测定 |
| Escherichia coli（重组表达） | 氨基醇不对称还原途径 | aadh突变体（S214R） | AADHw1（S214R突变体） | 催化 | kcat升至865 min⁻¹，Ki=11.8 mM，较野生型活性提高约3.3倍，产物耐受性提高约2倍 |
| Escherichia coli（重组表达） | 氨基醇不对称还原途径 | aadh突变体（G73S） | AADHw2（G73S突变体） | 催化 | Km升至390 μM，Ki=15.2 mM，提示Gly73参与底物结合；在80 mg/ml dPE下仍可产EPE |
| Escherichia coli（重组表达） | 氨基醇不对称还原途径 | aadh突变体（G73S/S214R） | AADHm1（双突变体） | 催化 | kcat=874 min⁻¹，Km=406 μM，Ki=17.3 mM；生物转化中EPE产量达70.7 mg/ml，摩尔产率87.6% |
关键发现
- ['筛选约5000个克隆，获得两个有益突变体AADHw1（S214R）和AADHw2（G73S），并构建双突变体AADHm1（G73S/S214R）', '在80 mg/ml dPE-HCl存在下，表达突变酶的E. coli转化细胞可产生2-7 mg/ml EPE产物，而野生型几乎无活性
- 在100 mg/ml dPE-HCl下AADHm1仍产生约6 mg/ml EPE-HCl', '生物转化实验中，野生型AADH在EPE-HCl约40 mg/ml后停止生产，而AADHm1可生产至70.7 mg/ml（328.0 mM），摩尔反应产率87.6%', '动力学参数（0.32 mM NADPH）：野生型kcat=264 min⁻¹, Km=295 μM, kcat/Km=0.90 μM⁻¹·min⁻¹, Ki=5.7 mM
- AADHw1（S214R）：kcat=865, Km=290, kcat/Km=2.99, Ki=11.8
- AADHw2（G73S）：kcat=278, Km=390, kcat/Km=0.71, Ki=15.2
- AADHm1（G73S/S214R）：kcat=874, Km=406, kcat/Km=2.16, Ki=17.3', '所有突变体的Ki值比野生型提高2-3倍，其中AADHm1的Ki达17.3 mM', 'S214R突变使kcat提高约3.3倍，G73S突变使Km提高约1.3倍，双突变结合了两者优势']
研究结论
通过随机突变成功改善了AADH的催化活性和产物抑制耐受性，双突变体AADHm1在产物存在下活性最高，有望应用于dPE等双手性氨基醇的工业化生产，并为SDR家族酶的结构-功能关系研究提供了线索。