\(^{13}\mathrm{C}\) -based metabolic flux analysis of Saccharomyces cerevisiae with a reduced Crabtree effect
- 作者
- Shuichi Kajihata, Fumio Matsuda, Mika Yoshimi, Kenshi Hayakawa, Chikara Furusawa, Akihisa Kanda, Hiroshi Shimizu
- 单位
- Department of Bioinformatic Engineering, Graduate School of Information Science and Technology, Osaka University; KANEKA Fundamental Technology Research Alliance Laboratories, Graduate School of Engineering, Osaka University; Quantitative Biology Center, RIKEN; New & Fundamental Technology Group Process Technology Laboratories, KANEKA Corporation
- 杂志
- Journal of Bioscience and Bioengineering（2015）
- DOI
- 10.1016/j.jbiosc.2014.12.014
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
表征S288C衍生酿酒酵母菌株在降低Crabtree效应条件下的代谢状态，特别是磷酸戊糖途径（PP途径）的活性和线粒体乙酰-CoA供应的主要途径，并与ATCC32167菌株结果进行比较。
研究策略
利用葡萄糖限制恒化培养（稀释率0.1 h^-1）抑制Crabtree效应，结合13C标记葡萄糖（[U-13C]、[1-13C]和天然葡萄糖混合物）进行13C-MFA，通过GC-MS测定蛋白质氨基酸标记模式，使用OpenMebius估算代谢通量，并计算NADPH和ATP平衡。
核心内容
本研究对S288C衍生酿酒酵母YM1菌株在降低Crabtree效应条件下的代谢状态进行了13C标记的代谢通量分析。通过葡萄糖限制恒化培养（稀释率0.1 h⁻¹）抑制Crabtree效应，结合[U-¹³C]、[1-¹³C]与天然葡萄糖混合底物进行标记实验，采用GC-MS检测蛋白质氨基酸标记模式，利用OpenMebius估算代谢通量。结果显示，该菌株仅产生少量乙酸，生物量产率达0.48 C-mol/C-mol葡萄糖。通量分析发现磷酸戊糖途径通量（72.5）远高于糖酵解途径（12.9），成为NADPH的主要来源。关键发现是线粒体乙酰-CoA主要由丙酮酸脱氢酶（PDH）反应供应（通量90.1），而非丙酮酸脱羧酶（PDC）途径，这与ATCC32167菌株的结果不同。NADPH平衡显示其产生速率（2.83 mmol gDCW⁻¹ h⁻¹）远超生物合成需求（0.931 mmol gDCW⁻¹ h⁻¹），提示存在未知的胞质NADPH再氧化机制。该研究揭示了酿酒酵母在氧化条件下通过上调磷酸戊糖途径满足辅因子需求并保证高生物量产率的共同适应机制。
创新点
['首次对S288C衍生酿酒酵母菌株在降低Crabtree效应下进行13C-MFA，发现PDH途径而非PDC途径是线粒体乙酰-CoA的主要供应途径，与ATCC32167菌株的结果不同。', '证实PP途径通量升高（72.5）显著高于EMP途径（12.9），是氧化条件下的共同适应机制，为细胞生长提供NADPH。', '通过置信区间估计表明PDH和PDC通量的区分存在内在困难，但本研究采用混合标记底物和现代置信区间估计方法提高了可靠性。']
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae YM1 | 丙酮酸代谢 | — | 丙酮酸脱氢酶复合体（PDH） | 催化 | 催化丙酮酸脱羧产生乙酰-CoA，是线粒体乙酰-CoA的主要来源（通量90.1） |
| Saccharomyces cerevisiae YM1 | 丙酮酸发酵途径 | — | 丙酮酸脱羧酶（PDC） | 催化 | 催化丙酮酸脱羧为乙醛，在降低Crabtree效应条件下该途径通量较低 |
| Saccharomyces cerevisiae YM1 | 磷酸戊糖途径 | — | 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH） | 催化 | PP途径氧化阶段第一步，提供NADPH，通量贡献超过60% |
| Saccharomyces cerevisiae YM1 | 磷酸戊糖途径 | — | 6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶（6PGDH） | 催化 | PP途径氧化阶段第二步，与G6PDH共同提供NADPH |
| Saccharomyces cerevisiae YM1 | 线粒体乙酰-CoA转运 | — | 乙酰-CoA转运系统 | 转运 | 胞质乙酰-CoA转运至线粒体的过程（通量-4.5），在S288C中作用较小 |
关键发现
在葡萄糖限制恒化培养（稀释率0.1 h^-1）下，S. cerevisiae YM1菌株仅产生少量乙酸（0.023 mmol gDCW^-1 h^-1），未检测到乙醇和甘油。生物量产率为0.48 C-mol C-mol glucose^-1，葡萄糖摄取率为1.18 mmol gDCW^-1 h^-1。代谢通量分析显示PP途径通量（72.5）远高于EMP途径（12.9，相对葡萄糖摄取率100）。PDH反应通量为90.1（90%置信区间52.1-92.5），而胞质至线粒体乙酰-CoA转运通量为-4.5（90%置信区间-4.5-32.5），表明线粒体乙酰-CoA主要由PDH途径供应。NADPH产生速率为2.83 mmol gDCW^-1 h^-1，其中超过60%来自PP途径，而生物合成所需NADPH为0.931 mmol gDCW^-1 h^-1，造成NADPH过剩。ATP产生速率为10.4 mmol gDCW^-1 h^-1，消耗速率为8.81 mmol gDCW^-1 h^-1，其中64%的ATP由呼吸链提供。
研究结论
在降低Crabtree效应的S288C衍生菌株中，线粒体乙酰-CoA主要由丙酮酸脱氢酶（PDH）反应供应，而非PDC途径。PP途径通量升高是酿酒酵母氧化条件下的共同适应机制，通过提供NADPH促进高生物量产率。NADPH和ATP平衡显示存在未知的胞质NADPH再氧化机制，且P/O比值可能低于1.0。