Purification and enzymatic characterization of secretory glycoside hydrolase family 3 (GH3) aryl β-glucosidases screened from Aspergillus oryzae genome
- 作者
- Kanako Kudo, Akira Watanabe, Seiryu Ujiie, Takahiro Shintani, Katsuya Gomi
- 单位
- Laboratory of Bioindustrial Genomics, Department of Bioindustrial Informatics and Genomics, Graduate School of Agricultural Science, Tohoku University, 1-1 Tsutsumidori-Amamiyamachi, Aoba-ku, Sendai 981-8555, Japan
- 杂志
- Journal of Bioscience and Bioengineering（2015）
- DOI
- 10.1016/j.jbiosc.2015.03.019
- 所属领域
- 发酵工程
- 关键词
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解决的核心问题
米曲霉基因组中多个GH3 β-葡萄糖苷酶基因未被表征，需要筛选并鉴定具有工业应用价值（如乙醇耐受、宽pH稳定性、高催化活性）的芳基β-葡萄糖苷酶。
研究策略
基于米曲霉基因组和CAZy数据库全局筛选含信号肽的GH3 β-葡萄糖苷酶基因，利用改良glaA启动子在米曲霉AOK11中过表达，通过MUG平板筛选、蛋白纯化及酶学表征鉴定新型芳基β-葡萄糖苷酶。
核心内容
该研究通过基因组挖掘策略，从米曲霉基因组中23个GH3候选β-葡萄糖苷酶基因中筛选出10个含信号肽的基因，利用改良glaA启动子在米曲霉AOK11中过表达，并通过MUG平板筛选获得三个新型分泌型芳基β-葡萄糖苷酶BglA、BglF和BglJ。纯化后的酶学表征显示，BglA、BglF和BglJ对pNPGlc的比活力分别为319、0.6和168 U/mg，其中BglA和BglJ表现出较高催化效率，对pNPGlc的kcat/Km分别为868和777 s⁻¹ mM⁻¹。三个酶在温度和pH偏好上存在差异，BglA最适温度50°C、最适pH 5.5，且在pH 4.5至10的宽范围内保持稳定，而BglJ在pH 8.0即失活。在14%乙醇存在下，BglA对pNPGlc保留约60%活性，而BglJ仅保留约14%。BglA对大豆苷、黄豆黄苷和染料木苷的比活力分别为8.31、7.93和10.5 U/mg，分别是BglJ的7.6倍、11.8倍和8.9倍。结果表明，BglA兼具宽pH稳定性、乙醇耐受性和高效异黄酮糖苷水解活性，在异黄酮苷元生产中具有应用潜力，基因组挖掘策略为发现新型工业用糖苷酶提供了有效途径。
创新点
新发现并表征了三个分泌型GH3芳基β-葡萄糖苷酶BglA、BglF和BglJ；其中BglA表现出宽pH稳定性（pH 4.5-10）和较高的乙醇耐受性，在异黄酮糖苷水解中显著优于BglJ，具有工业应用潜力。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Aspergillus oryzae AOK11 | β-葡萄糖苷水解 | bglA (A0090038000223) | BglA | 催化 | 分泌型GH3芳基β-葡萄糖苷酶；比活力319 U/mg（pNPGlc），最适温度50°C，pH 5.5，宽pH稳定（4.5-10），乙醇耐受性强，能高效水解异黄酮糖苷 |
| Aspergillus oryzae AOK11 | β-葡萄糖苷水解 | bglF (A0090103000127) | BglF | 催化 | 分泌型GH3芳基β-葡萄糖苷酶；比活力0.6 U/mg（pNPGlc），最适温度45°C，pH 6.0，比活力较低 |
| Aspergillus oryzae AOK11 | β-葡萄糖苷水解 | bglJ (A0090003001511) | BglJ | 催化 | 分泌型GH3芳基β-葡萄糖苷酶；比活力168 U/mg（pNPGlc），最适温度40°C，pH 4.5，热稳定性和碱稳定性差，乙醇耐受性低 |
| Escherichia coli DH5α | 质粒构建 | — | — | 调控 | 用于重组质粒构建的宿主菌 |
关键发现
- 从米曲霉基因组23个GH3候选基因中筛选出10个含信号肽的基因并进行过表达，其中bglA（A0090038000223）、bglF（A0090103000127）和bglJ（A0090003001511）表现芳基β-葡萄糖苷酶活性。纯化后BglA、BglF、BglJ的比活力分别为6.79、0.58、10.5 U/mg；对pNPGlc的比活力分别为319、0.6、168 U/mg；对纤维二糖的比活力仅为pNPGlc的约6%、1%、12%。BglA和BglJ对pNPGlc的Km分别为0.75 mM和0.48 mM，kcat分别为651 s⁻¹和373 s⁻¹，kcat/Km分别为868和777 s⁻¹ mM⁻¹；对熊果苷的kcat/Km分别为361和987 s⁻¹ mM⁻¹。BglA最适温度50°C、最适pH
- 5，BglF为45°C、pH
- 0，BglJ为40°C、pH
- 5。BglA在pH
- 5-10范围内稳定，BglJ在pH
- 0即失活。在14%（v/v）乙醇存在下，BglA对pNPGlc保留约60%活性，而BglJ仅保留约14%。BglA对大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷的比活力分别为8.31、7.93、10.5 U/mg，分别是BglJ的7.6倍、11.8倍、8.9倍。
研究结论
从米曲霉基因组挖掘到的BglA是一种具有宽pH稳定性和乙醇耐受性的芳基β-葡萄糖苷酶，能高效水解异黄酮糖苷，在异黄酮苷元生产中具有应用价值。基因组挖掘策略有助于发现新型工业用β-葡萄糖苷酶。