How physiological and cultural conditions influence heterologous protein production in Kluyveromyces lactis
- 作者
- Annamaria Merico, Daniele Capitanio, Ileana Vigentini, Bianca Maria Ranzi, Concetta Compagno
- 单位
- Dipartimento di Scienze Biomolecolari e Biotecnologie, Sezione di Biochimica Comparata, Università degli Studi di Milano, Via Celoria 26, 20133 Milan, Italy
- 杂志
- Journal of Biotechnology（2004）
- DOI
- 10.1016/j.jbiotec.2003.10.031
- 所属领域
- 发酵工程
- 关键词
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解决的核心问题
研究生理和培养条件（碳源、pH、培养基组成）对克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）异源蛋白（葡糖淀粉酶）生产的影响，并优化生产条件。
研究策略
采用摇瓶和生物反应器批式培养，比较野生型JA6和分泌增强型突变体dgr151表达异源葡糖淀粉酶的生产性能，系统分析pH、碳源、培养基富集等因素对细胞生长、碳源消耗、酶活和稳定性的影响。
研究路线图
核心内容
该研究系统考察了生理与培养条件对克鲁维酵母异源葡糖淀粉酶生产的影响，以野生型JA6和分泌增强型突变体dgr151为对象，通过摇瓶和生物反应器批式培养，分析碳源、pH及培养基富集等因素的作用。结果显示，乳糖为最佳碳源，但摇瓶培养中碳源未被完全消耗，pH降至3.0–3.5，酶活达峰后24小时内下降近半。在pH 6.0批式培养中，两菌株可完全利用乳糖，JA6-GAA和dgr151-GAA的最高酶活分别达18.56 U/ml和14.76 U/ml，比产量为4.13 U/mg和2.67 U/mg。加入1.3%酪蛋白氨基酸后，dgr151-GAA在摇瓶中比产量提高至4.18 U/mg，约为最低培养基的3倍，批式培养生产率升至5.64 U/ml/h；而JA6-GAA比产量反降至2.98 U/mg。pH 6.0下酶活在140小时内保持稳定。该结果表明维持pH 6.0并以乳糖为碳源是提升异源蛋白生产的关键，培养基富集仅对分泌增强突变体有利，为克鲁维酵母生产过程的规模放大提供了重要生理学依据。
创新点
发现维持pH 6.0能显著延长产酶时间并稳定酶活性；确定乳糖为最佳碳源；揭示培养基富集对突变体的促进作用和对野生型菌株的负面影响，为K. lactis异源蛋白生产的规模放大提供了生理学依据。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Kluyveromyces lactis JA6 | 蛋白质分泌途径 | AaGAA | 葡糖淀粉酶 | 催化 | 野生型菌株表达来自Arxula adeninivorans的葡糖淀粉酶基因，用于水解淀粉 |
| Kluyveromyces lactis dgr151 | 蛋白质分泌途径 | AaGAA | 葡糖淀粉酶 | 催化 | 葡萄糖抑制缺陷突变体，显示出更高的分泌能力 |
| Kluyveromyces lactis JA6 | 葡萄糖代谢与转运 | KHT2 | 己糖转运蛋白 | 转运 | JA6菌株特有的己糖转运蛋白基因，导致其发酵性表型 |
| Kluyveromyces lactis dgr151 | 葡萄糖代谢调控 | 未知突变 | 未知 | 调控 | 葡萄糖抑制缺陷突变，促进异源蛋白分泌 |
关键发现
- 摇瓶培养中，乳糖是最好的碳源，但碳源未被完全消耗，pH降至3.0-3.5，酶活峰值后24h内下降近一半；在pH
- 0的批式培养中，两菌株可完全利用乳糖，JA6-GAA和dgr151-GAA的最高酶活分别达到18.56 U/ml和14.76 U/ml，比产量分别为4.13 U/mg和2.67 U/mg，体积生产率分别为3.40 U/ml/h和2.54 U/ml/h；培养基加入1.3%酪蛋白氨基酸后，摇瓶中dgr151-GAA比产量提高至4.18 U/mg（较最低培养基提高约3倍），批式培养中其生物量产率提高至0.44 g/g，生产率提高至5.64 U/ml/h，而JA6-GAA比产量下降至2.98 U/mg；pH
- 0下酶活在140h内保持稳定。
研究结论
维持pH 6.0和以乳糖为碳源是提高K. lactis异源葡糖淀粉酶生产的关键；培养基富集仅对分泌增强突变体dgr151有显著促进作用，对野生型JA6反而不利。