High-level secretory production of recombinant bovine enterokinase light chain by Pichia pastoris
- 作者
- Lisheng Peng, Xiaofen Zhong, Jingxing Ou, Suilan Zheng, Jian Liao, Lei Wang, Anlong Xu
- 单位
- The Open Laboratory for Marine Functional Genomics of State High-Tech Development, Department of Biochemistry, College of Life Sciences, Sun Yat-Sen (Zhongshan) University, Guangzhou 510275, PR China
- 杂志
- Journal of Biotechnology（2003）
- DOI
- 10.1016/j.jbiotec.2003.11.004
- 所属领域
- 发酵工程
- 关键词
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解决的核心问题
重组牛肠激酶轻链（EK_L）在毕赤酵母中表达水平低、成本高，限制了其应用。
研究策略
利用毕赤酵母Mut^s菌株，优化诱导pH、碳源组成和诱导时间，采用高密度补料分批发酵实现EK_L的高水平分泌表达，并建立简单纯化流程及His标签辅助去除策略。
研究路线图
核心内容
本研究针对重组牛肠激酶轻链（EK_L）在毕赤酵母中表达水平低的问题，系统考察了宿主甲醇利用表型、诱导pH及碳源组成对蛋白分泌的影响，并据此优化高密度补料分批发酵策略。结果显示，采用Mut^s菌株、维持诱导pH 6.0并以甘油/甲醇混合碳源诱导96 h，可使rEK_L产量达到350 mg/L，为纯甲醇诱导（150 mg/L）的2.3倍，较文献报道提高约20倍。发酵上清经Q Sepharose阴离子交换一步纯化，获得纯度95%的rEK_L，总收率41%，比活约9000 u/mg，N端序列与天然蛋白一致。此外，构建的C端His标签变体（rEK_L/His，44 kDa）比活约8000 u/mg，与无标签版本活性相当，便于后续酶切去除。该工作通过发酵条件与宿主表型的协同优化，将EK_L分泌表达提升至工业化可用水平，证实毕赤酵母是生产功能性牛肠激酶轻链的可行宿主，为同类重组蛋白的高水平制备提供了可借鉴的策略。
创新点
首次系统研究甲醇利用表型（Mut^s vs Mut^+）、pH和碳源对EK_L分泌表达的影响；优化后rEK_L产量达350 mg/L，较之前报道提高20倍；开发了简便的阴离子交换纯化方法；构建了C端His标签的EK_L/His变体，便于酶切后去除。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Pichia pastoris GS115 | 甲醇利用途径（Mut^s/Mut^+） | 合成牛肠激酶轻链基因（EK_L） | 牛肠激酶轻链（EK_L） | 催化 | 重组EK_L为分泌表达，N端为α-factor信号肽，分子量约41 kDa，比活约9000 u/mg。 |
| Pichia pastoris GS115 | 甲醇利用途径（Mut^s） | C端His标签的EK_L基因（EK_L/His） | 带His标签的牛肠激酶轻链（rEK_L/His） | 催化 | C端His标签便于亲和层析纯化及酶切后去除，比活约8000 u/mg，与无标签EK_L相当。 |
关键发现
- Mut^s菌株的EK_L表达量显著高于Mut^+菌株
- 最佳诱导pH为6.0
- 以甘油/甲醇混合碳源诱导96 h时，rEK_L浓度达到350 mg/L，是纯甲醇诱导（150 mg/L）的2.3倍，是文献报道（Vozza et al., 1996）的20倍
- 甲醇+山梨醇组产量为250 mg/L
- 100 mL发酵上清经Q Sepharose纯化获得15 mg纯化rEK_L，纯度为95%，总收率41%
- 纯化rEK_L的比活约为9000 u/mg，N端序列为IVGGS，与天然牛EK_L一致
- EK_L/His分子量44 kDa，比活约8000 u/mg，与无标签EK_L活性相当
- rEK_L分子量约41 kDa
- 诱导时间超过120 h后重组蛋白浓度下降。
研究结论
通过优化毕赤酵母发酵条件（Mut^s表型、pH 6.0、甘油/甲醇混合碳源、96 h诱导），rEK_L表达量达到350 mg/L，实现了高水平分泌表达；纯化流程简单有效，C端His标签不影响活性且便于去除。毕赤酵母是生产功能性牛肠激酶轻链的可行宿主。