Engineered autolytic yeast strains secreting Kluyveromyces lactis β-galactosidase for production of heterologous proteins in lactose media
- 作者
- Manuel Becerra, Esther Rodríguez-Belmonte, M. Esperanza Cerdán, M. Isabel González Siso
- 单位
- Departamento de Bioloxía Celular e Molecular, Facultade de Ciencias, Universidade da Coruña, Campus da Zapateira s/n, 15071-A Coruña, Spain
- 杂志
- Journal of Biotechnology（2004）
- DOI
- 10.1016/j.jbiotec.2003.10.030
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
乳糖是乳清中的主要固体成分，但其直接利用困难；酵母β-半乳糖苷酶为胞内酶，提取和下游加工成本高，限制了工业应用。需要构建能利用乳糖且易于释放胞外蛋白的重组酵母菌株。
研究策略
利用Saccharomyces cerevisiae的渗透修复型热敏感自溶突变株（lyt2-1），分泌表达Kluyveromyces lactis的LAC4基因编码的β-半乳糖苷酶，使细胞无需乳糖透性酶即可在含乳糖培养基中生长，并通过渗透压休克释放胞外酶。
研究路线图
核心内容
针对乳糖作为乳清主要固体成分难以直接利用、且酵母β-半乳糖苷酶为胞内酶导致下游提取成本高的问题，本研究构建了能分泌β-半乳糖苷酶并实现胞外释放的重组酿酒酵母菌株。研究以携带渗透修复型热敏感自溶突变lyt2-1的酿酒酵母为底盘，异源表达克鲁维酵母LAC4基因编码的β-半乳糖苷酶，使菌株无需乳糖透性酶即可在乳糖培养基中生长，并借助渗透压休克促使胞内酶释放至胞外。关键结果方面，最优菌株LHDP1（lyt2-1 pep4 prb1缺陷）在含4%乳糖的YPL培养基中143小时消耗乳糖23.7 g/l，β-半乳糖苷酶生物量得率达12.3 EU/mg，渗透压休克后酶释放率达51%，且乙醇产量低于1.5 g/l，呈现氧化性代谢特征；其胞内酶活性平均为对照菌株LD1的2.5倍，而单独pep4缺陷菌株的乳糖消耗及胞外酶产量均显著更低。该研究证明自溶突变结合蛋白酶缺陷策略能有效实现乳糖利用与酶的高效胞外分泌，为降低乳清生物加工成本提供了可行方案。
创新点
构建了自溶型重组酵母菌株，使细胞生长不依赖乳糖摄取机制；利用渗透压休克实现β-半乳糖苷酶胞外释放，降低下游加工成本；LHDP1菌株在乳糖培养基中表现出氧化性代谢特征，低乙醇产量、高生物量。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae | 乳糖代谢 | LAC4 | β-半乳糖苷酶 | 催化 | 来自Kluyveromyces lactis，融合K. lactis killer毒素分泌信号，由PGK启动子和终止子控制 |
| Saccharomyces cerevisiae | 细胞壁合成/自溶 | lyt2-1 | — | 调控 | 热敏感自溶突变，非允许温度37°C下裂解，渗透压可修复 |
| Saccharomyces cerevisiae | 蛋白降解 | pep4 | 蛋白酶A | 调控 | 缺失pep4和prb1，降低蛋白酶活性，减少β-半乳糖苷酶降解 |
| Saccharomyces cerevisiae | 蛋白降解 | prb1 | 蛋白酶B | 调控 | 缺失降低蛋白酶活性 |
| Saccharomyces cerevisiae | 乳糖转运 | — | — | 转运 | 研究避免使用乳糖透性酶，通过分泌β-半乳糖苷酶使乳糖利用独立于摄取机制 |
关键发现
- LHDP1菌株在YPL-4%乳糖培养基中乳糖消耗23.7 g/l（143 h），YPL-6%中20.39 g/l（168 h）
- LD1菌株在168 h乳糖消耗分别为11.5 g/l（YPL-4%）和8.7 g/l（YPL-6%）。LHDP1的β-半乳糖苷酶生物量得率最高，YPL-4%为12.3 EU/mg，YPL-6%为5.03 EU/mg，乳清渗透物中约5.78 EU/mg
- 在YPD中LHDP1胞内酶活性平均为LD1的2.5倍。LHDP1在渗透压休克后β-半乳糖苷酶释放率达51%。LHDP1在乳糖培养基中乙醇产量低于1.5 g/l（除LD1在4%乳糖达到3.7 g/l但LHDP1低于15%理论值）。PEP4-1a菌株乳糖消耗仅3.3 g/l（YPL-4%）和7.96 g/l（YPL-6%），胞外酶比LHDP1低约4倍。
研究结论
构建的S. cerevisiae自溶突变株能够分泌K. lactis β-半乳糖苷酶，无需乳糖透性酶即可在含乳糖培养基中生长。LHDP1菌株（lyt2-1 pep4 prb1缺陷）在乳糖利用、β-半乳糖苷酶产量和胞外释放方面表现最佳，具有工业和乳品业应用潜力。