Improved mannitol production by a random mutant of Leuconostoc pseudomesenteroides
- 作者
- Miia Helanto, Johannes Aarnikunnas, Niklas von Weymarn, Ulla Airaksinen, Airi Palva, Matti Leisola
- 单位
- Laboratory of Bioprocess Engineering, Department of Chemical Technology, Helsinki University of Technology; Section of Microbiology, Department of Basic Veterinary Sciences, Faculty of Veterinary Medicine, University of Helsinki
- 杂志
- Journal of Biotechnology（2004）
- DOI
- 10.1016/j.jbiotec.2004.11.001
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
提高Leuconostoc pseudomesenteroides将果糖转化为甘露醇的产率，减少果糖向磷酸酮醇酶途径的泄漏，从而提升甘露醇的产量和生产效率。
研究策略
通过化学随机诱变构建无法利用果糖生长的突变菌株，筛选果糖激酶活性降低的突变体，并分析其果糖激酶基因fruK的序列与表达，结合发酵实验评估突变对甘露醇生产的影响。
研究路线图
核心内容
该研究通过化学随机诱变构建了Leuconostoc pseudomesenteroides的果糖激酶活性显著降低的突变株BPT143，以提升果糖向甘露醇的转化效率。研究分析了突变株的fruK基因序列、转录水平及发酵性能。结果显示，突变株的果糖激酶比活仅为野生型的约12%（0.06 U/mg对0.49 U/mg），甘露醇得率从73.7 mol%提高至85.7 mol%，体积产率从1.6 g/L/h提升至2.0 g/L/h，最大比生长速率亦有所增加。同时，副产物乳酸、乙醇和CO2产量降低，而乙酸产量升高。尽管检测不到fruK转录本，但fruK基因编码区仅存在一个沉默突变，上游启动子区域无变化。上述结果表明，降低果糖激酶活性可有效减少果糖向磷酸酮醇酶途径的泄漏，使更多底物流向甘露醇脱氢酶催化的还原反应。但活性未完全消除，故得率未达100%，进一步完全失活该酶或结合其他策略有望实现更高产率。
创新点
首次构建了果糖激酶活性显著降低（降至野生型10%）的L. pseudomesenteroides BPT143突变株，在不影响果糖摄取的情况下使甘露醇得率从74 mol%提高到86 mol%，同时提高了体积产率；并完成了fruK基因及其启动子的表征。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Leuconostoc pseudomesenteroides ATCC12291 | 果糖代谢/磷酸酮醇酶途径 | fruK | 果糖激酶 | 催化 | 野生型菌株，果糖激酶比活0.49 U/mg |
| Leuconostoc pseudomesenteroides BPT143 | 甘露醇合成/果糖代谢 | fruK | 果糖激酶 | 催化 | 化学诱变突变株，果糖激酶比活仅0.06 U/mg，fruK转录缺失，无法利用果糖生长但可转化果糖为甘露醇 |
| Leuconostoc pseudomesenteroides BPT143 | 甘露醇合成 | — | 甘露醇脱氢酶 | 催化 | 突变株中甘露醇脱氢酶比活0.067 U/mg，与野生型（0.058 U/mg）无显著差异 |
关键发现
- 突变株BPT143的果糖激酶比活为0.06 U/mg（野生型为0.49 U/mg）
- 甘露醇得率由73.7±0.6 mol%提升至85.7±0.4 mol%
- 体积甘露醇产率由1.6±0.0 g/l/h提升至2.0±0.0 g/l/h（摘要中为2.1到2.8，表格中为1.6到2.0，两者不同，以表格为准）
- 最大比生长速率由0.59±0.04 h^-1提升至0.69±0.01 h^-1
- 果糖消耗速率（t=2-6h）由6.0±0.2 g/g cdw/h提升至6.5±0.1 g/g cdw/h
- 副产物乳酸、乙醇和CO2产量降低，乙酸产量升高
- fruK转录本在突变株中检测不到，但fruK基因序列仅有一个沉默突变（Thr104），上游450bp区域无突变。
研究结论
降低果糖激酶活性可有效减少果糖向磷酸酮醇酶途径的泄漏，使更多果糖被甘露醇脱氢酶还原为甘露醇，从而提高甘露醇得率和生产率。但由于果糖激酶活性未完全消除，未能实现100%得率；完全失活果糖激酶或结合其他工程手段有望进一步提高产率。