Effect of different levels of NADH availability on metabolic fluxes of Escherichia coli chemostat cultures in defined medium
- 作者
- Ailen M. Sánchez, George N. Bennett, Ka-Yiu San
- 单位
- Department of Bioengineering, Rice University; Department of Biochemistry and Cell Biology, Rice University; Department of Chemical Engineering, Rice University
- 杂志
- Journal of Biotechnology（2005）
- DOI
- 10.1016/j.jbiotec.2005.02.006
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
研究不同水平的NADH可用性对大肠杆菌在限定培养基恒化培养中代谢通量分布的影响，探索通过调节NADH/NAD+辅因子对来重定向代谢通量的策略。
研究策略
利用不同氧化态的碳源（葡萄糖酸、葡萄糖、山梨醇）和过表达来自博伊丁假丝酵母（Candida boidinii）的NAD+依赖型甲酸脱氢酶（FDH）来产生一系列细胞内NADH可用性水平，在恒化培养（稀释率0.05 h^-1）稳态下测定代谢通量、NADH/NAD+比值及NAD(H+)总量，并与不含异源FDH的对照菌株比较。
研究路线图
核心内容
该研究在大肠杆菌限定培养基恒化培养中，通过组合不同氧化态碳源（葡萄糖酸、葡萄糖、山梨醇）与过表达来自博伊丁假丝酵母的NAD⁺依赖型甲酸脱氢酶（FDH），系统调控细胞内NADH可用性，并考察其对代谢通量重分布的影响。稳态下代谢物和辅因子测定显示，FDH过表达使各碳源下的NADH/NAD⁺比值均升高，而总NAD(H⁺)水平基本不变。关键结果是乙醇/乙酸比值随NADH可用性提高而显著增加，从对照菌株在葡萄糖中的1.05升至山梨醇加FDH菌株的9.45；同时乙酸比产率在葡萄糖酸加对照中最高，约为山梨醇加FDH最低值的6倍，乳酸比产率也从约0.5降至低于0.1 mmol/(g D.W. h)。但山梨醇加FDH组合中乙醇产量未进一步增加，提示还原力可能过剩。研究证实通过碳源氧化态与FDH过表达可有效将通量从乙酸和乳酸转向乙醇，但当NADH供应过高时更适合生产更还原的化合物，且限定培养基中细胞通过同时调节乙醇和乙酸通量维持氧化还原平衡。
创新点
['在限定培养基中结合碳源氧化态和异源NAD+依赖FDH过表达，实现了从1到5 mol NADH/mol底物的理论NADH产量梯度，并系统评估了代谢通量重分布', '发现乙醇/乙酸比值随NADH可用性增加而显著提高，最高达9.45（山梨醇+FDH菌株），而对照组在葡萄糖中仅为1.05', '揭示了在限定培养基中，细胞通过同时调节乙醇和乙酸通量来达到氧化还原平衡，与复杂培养基中主要调节乙醇通量的机制不同']
研究对象（1）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli GJT001 | 厌氧混合酸发酵（中央代谢） | fdh1 | NAD+依赖型甲酸脱氢酶（FDH，来自Candida boidinii） | 催化 | 过表达该酶将甲酸（1 mol）转化为NADH（1 mol）和CO2，用于增加细胞内NADH可用性；对照菌株仅含空载体pDHK29 |
关键发现
- ['过表达NAD+依赖FDH后，三种碳源下的NADH产量和NADH/NAD+比值均高于对照，总NAD(H+)水平在各组合间相似', '乙醇/乙酸比值从对照菌株在葡萄糖中的1.05增加到表达异源FDH菌株在山梨醇中的9.45', '乙酸比产率在葡萄糖酸+对照菌株中最高，约为山梨醇+FDH菌株最低值的6倍', '乳酸比产率在葡萄糖酸+对照菌株中约为0.5 mmol/(g D.W. h)，在葡萄糖酸+FDH菌株中降至低于0.1 mmol/(g D.W. h)', '山梨醇+FDH菌株的乙醇比产率约为8 mmol/(g D.W. h)，约为对照菌株在葡萄糖中的两倍', 'FDH菌株的葡萄糖和葡萄糖酸摄取率比对照降低约20%，但山梨醇摄取率比对照提高30%以上', '实验NADH产量（NADH_U/CS）范围为1.02至3.11 mol/mol，而理论值范围为1至5 mol/mol', '在山梨醇+FDH组合中，乙醇产量未进一步增加，且新FDH通量较葡萄糖和葡萄糖酸时降低，提示可能存在NADH过量饱和', '细胞内NADH浓度在1-2 μmol/g D.W.之间，NAD+浓度在2.4-3.5 μmol/g D.W.之间
- 过表达FDH使NADH/NAD+比值在各碳源下均升高', '碳摩尔产率分析显示，FDH过表达在葡萄糖中使乙酸产率从0.25降至0.13 C-mol/C-mol，而在山梨醇中降至0.05
- 乙醇产率在葡萄糖中从0.26升至0.41，但山梨醇中基本不变（0.52 vs 0.49）']
研究结论
通过结合碳源氧化态调控和异源NAD+依赖FDH过表达，可以有效地提高大肠杆菌细胞内NADH可用性，并驱动代谢通量从乙酸和乳酸转向乙醇，显著提高乙醇/乙酸比值。然而，当NADH供应过高时（如山梨醇+FDH组合），细胞可能因还原力过剩而无法进一步增加乙醇产量，该组合可能更适合生产比乙醇更还原的化合物。研究还表明，限定培养基中细胞通过同时调节乙醇和乙酸通量来维持氧化还原平衡，与复杂培养基的机制不同。