Expression of the Arabidopsis feedback-insensitive anthranilate synthase holoenzyme and tryptophan decarboxylase genes in Catharanthus roseus hairy roots
- 作者
- Seung-Boom Hong, Christie A.M. Peebles, Jacqueline V. Shanks, Ka-Yiu San, Susan I. Gibson
- 单位
- Department of Biochemistry and Cell Biology, Rice University; Department of Bioengineering, Rice University; Department of Chemical and Biological Engineering, Iowa State University; Department of Plant Biology, University of Minnesota
- 杂志
- Journal of Biotechnology（2005）
- DOI
- 10.1016/j.jbiotec.2005.08.008
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在长春花（Catharanthus roseus）毛状根中，单独表达反馈不敏感的邻氨基苯甲酸合酶α亚基（trp5）或色氨酸脱羧酶（TDC）不能显著提高萜类吲哚生物碱（TIA）产量，因为缺乏ASβ亚基导致全酶活性受限，且内源TDC活性不足。
研究策略
在组成型启动子（CaMV 35S）控制下共表达野生型拟南芥ASβ亚基（ASB1）基因，同时用地塞米松（DEX）诱导型启动子表达反馈不敏感的ASα（trp5）和/或TDC，构建trp5:ASB1双基因和trp5:ASB1:TDC三基因表达体系，通过发根农杆菌转化获得转基因毛状根，分析酶动力学和代谢产物积累。
研究路线图
核心内容
该研究针对长春花毛状根中单独表达反馈不敏感的邻氨基苯甲酸合酶α亚基（trp5）或色氨酸脱羧酶（TDC）难以提升萜类吲哚生物碱（TIA）产量的问题，采用代谢工程策略共表达拟南芥野生型ASβ亚基（ASB1）与反馈不敏感的ASα，构建了trp5:ASB1双基因及trp5:ASB1:TDC三基因表达体系，并以组成型或地塞米松（DEX）诱导型启动子驱动表达。结果显示，共表达ASB1后，AS对色氨酸反馈抑制的耐受性显著增强，Ki值由未诱导系的5 μM提升至45 μM；诱导的trp5:ASB1系色氨酸积累约为3.0 mg/g DW，色胺比trp5系提高9倍；三基因系诱导后色胺高达3.5 mg/g DW，较未诱导提高14倍，TDC活性增加3倍。低剂量短时诱导可暂时促进tabersonine等生物碱积累，但长时间诱导反而降低aspidosperma类含量，表明下游TIA分支途径受到精细调控。该研究证实ASβ亚基对色氨酸合成至关重要，并揭示了前体供给增强对TIA积累的瞬时效应。
创新点
首次将野生型ASβ亚基（ASB1）与反馈不敏感ASα（trp5）共表达形成全酶，使AS对色氨酸反馈抑制的灵敏度降低（Ki提高4.5倍）；发现ASβ亚基对体内色氨酸合成及色胺大量积累具有关键作用；证实前体供给增强可短暂促进TIA积累。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Catharanthus roseus hairy roots | 色氨酸合成/吲哚途径 | trp5 | 邻氨基苯甲酸合酶α亚基（反馈不敏感突变体） | 催化 | 来自拟南芥，受糖皮质激素诱导型启动子控制 |
| Catharanthus roseus hairy roots | 色氨酸合成/吲哚途径 | ASB1 | 邻氨基苯甲酸合酶β亚基（野生型） | 催化 | 来自拟南芥，组成型表达，提供氨基转移活性 |
| Catharanthus roseus hairy roots | 色胺合成/吲哚途径 | TDC | 色氨酸脱羧酶 | 催化 | 来自长春花，受糖皮质激素诱导型启动子控制 |
| Catharanthus roseus hairy roots | 基因表达调控 | GVG | 杂合转录因子 | 调控 | 由甘露碱合酶启动子组成型表达，激活地塞米松诱导启动子 |
关键发现
- 诱导后，trp5:ASB1毛状根系（ASαβ1）的AS活性较未诱导提高2.2倍，trp5:ASB1:TDC（ASαβT2）提高2.7倍
- 色氨酸抑制AS的Ki值在trp5系为10μM，在trp5:ASB1和trp5:ASB1:TDC系为45μM，而未诱导系均为5μM。诱导的ASαβ1系色氨酸比trp5系高1.8倍（约3.0 mg/g DW），色胺高9倍（ASαβ1约1.9 mg/g DW，trp5系约0.3 mg/g DW）
- ASαβT2诱导后色胺高达3.5 mg/g DW，比未诱导高14倍。TDC活性在ASαβT2诱导后增加3倍（达1.6 nmol/min/mg），而ASα和ASαβ系TDC活性不变（约0.49 nmol/min/mg）。低剂量DEX（0.2 μM）诱导8-24h可使tabersonine、lochnericine及ajmalicine暂时性增加，但长时间诱导（48-72h）导致aspidosperma类生物碱降低。
研究结论
共表达ASβ亚基（ASB1）与反馈不敏感ASα（trp5）能显著增强邻氨基苯甲酸合酶对色氨酸反馈抑制的耐受性，提高色氨酸和色胺的积累，且额外表达TDC可进一步大幅提升色胺产量；但生物碱的积累受诱导强度和持续时间影响，呈瞬时动态变化，表明下游TIA分支途径存在精细调控。