Stress-related differential expression of multiple β-carotene ketolase genes in the unicellular green alga Haematococcus pluvialis
- 作者
- Jun-Chao Huang, Feng Chen, Gerhard Sandmann
- 单位
- Department of Botany, The University of Hong Kong, Pokfulam Road, Hong Kong, PR China; Botanical Institute, J.W. Goethe University Frankfurt, P.O. Box 111932, D-60054 Frankfurt, Germany
- 杂志
- Journal of Biotechnology（2005）
- DOI
- 10.1016/j.jbiotec.2005.09.002
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
雨生红球藻（Haematococcus pluvialis）中β-胡萝卜素酮化酶（bkt）基因的数量及其在不同胁迫条件下调节虾青素合成的机制尚不清楚。
研究策略
通过PCR、3'RACE和Southern blot从同一株雨生红球藻中鉴定bkt基因家族，利用在大肠杆菌中的异源表达验证新基因bkt3的功能，并结合多重RT-PCR和实时定量RT-PCR分析不同胁迫条件下bkt基因的表达差异及虾青素积累。
研究路线图
核心内容
该研究针对雨生红球藻中β-胡萝卜素酮化酶基因家族及其胁迫响应机制展开。通过PCR、3′RACE和Southern blot，从单一菌株NIES-144中鉴定出三个bkt基因（bkt1、bkt2及新发现的bkt3），后者与bkt2编码区仅22个核苷酸差异。在大肠杆菌中异源表达bkt3，证实其可将β-胡萝卜素转化为海胆酮和角黄素，但无法合成虾青素。利用实时定量RT-PCR分析不同胁迫下的表达差异，结果显示氮缺乏单独处理16小时仅使bkt表达提高3倍且不积累虾青素，而高光（125 μmol m⁻² s⁻¹）和45 mM乙酸钠分别使表达量提高18倍和52倍，并在3天内积累约7 mg/g和6 mg/g干重的虾青素。当bkt转录水平达到约1.6×10⁻⁶ fmol/ng总RNA时，细胞即可大量合成虾青素。研究表明多个bkt基因的存在及其差异调控使总转录本易于达到虾青素合成阈值，这解释了雨生红球藻在胁迫下快速积累虾青素的分子基础。
创新点
首次在单一雨生红球藻菌株中发现并证实了三个不同的β-胡萝卜素酮化酶基因（bkt1、bkt2和bkt3）共存；首次通过实时定量RT-PCR定量分析了不同胁迫条件下三个bkt基因的差异表达；发现bkt3是一个新的β-胡萝卜素酮化酶基因。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Haematococcus pluvialis | 虾青素生物合成通路（类胡萝卜素合成） | bkt1 (crtO) | β-胡萝卜素酮化酶 | 催化 | GenBank登录号X86782，受高光和氮缺乏诱导表达 |
| Haematococcus pluvialis | 虾青素生物合成通路（类胡萝卜素合成） | bkt2 (bkt) | β-胡萝卜素酮化酶 | 催化 | GenBank登录号D45881，受高浓度乙酸钠/NaCl诱导 |
| Haematococcus pluvialis | 虾青素生物合成通路（类胡萝卜素合成） | bkt3 | β-胡萝卜素酮化酶 | 催化 | 新发现的第三个基因，GenBank登录号AY603347，与bkt2高度同源 |
| Escherichia coli | 异源表达类胡萝卜素合成（pACCAR16ΔcrtX等） | bkt3 | β-胡萝卜素酮化酶 | 催化 | 用于功能验证，能将β-胡萝卜素转化为海胆酮和角黄素 |
关键发现
- 雨生红球藻NIES-144同时含有bkt1、bkt2和bkt3三个β-胡萝卜素酮化酶基因。bkt3为新的第三个基因，与bkt2核苷酸序列有95%同源性（编码区仅22个核苷酸差异，导致2个氨基酸差异）。bkt3在大肠杆菌中异源表达能将β-胡萝卜素转化为海胆酮和角黄素，但不能合成虾青素。氮缺乏单独处理16h可使bkt基因表达量提高至正常生长细胞的3倍，但3天内不能诱导虾青素积累
- 高光（125 μmol m^-2 s^-1）或45 mM乙酸钠可分别使bkt基因表达提高18倍和52倍，并在3天内积累约6-7 mg/g干重的虾青素（高光约7 mg/g，乙酸钠约6 mg/g）。14.8 mM乙酸钠使bkt表达提高约2倍但不产生虾青素。当bkt转录水平达到约1.6×10^-6 fmol/ng总RNA时，细胞即可产生大量虾青素。
研究结论
雨生红球藻含有三个受不同环境因子差异调控的bkt基因。多个bkt基因的存在及其在胁迫条件下的高表达使得细胞的总bkt mRNA容易达到启动虾青素大量合成所需的阈值，这解释了雨生红球藻在胁迫环境下快速积累大量虾青素的原因。