Effects of recombinant precursor pathway variations on poly[(R)-3-hydroxybutyrate] synthesis in Saccharomyces cerevisiae
- 作者
- Ross Carlson, Friedrich Sirenc
- 单位
- Department of Chemical Engineering and Materials Science, and BioTechnology Institute, University of Minnesota, Minneapolis/St. Paul, MN 55108, USA
- 杂志
- Journal of Biotechnology（2006）
- DOI
- 10.1016/j.jbiotec.2006.01.035
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
在酿酒酵母中，重组前体通路（R-3-羟基丁酰-CoA）的不同组合如何影响PHB合成速率和积累水平。
研究策略
利用双向GAL1-10启动子系统，在酿酒酵母中组合表达Cupriavidus necator的PHB合成途径基因（β-酮硫解酶、还原酶、合酶），通过差异化的前体供给增强PHB合成，并考察好氧/厌氧条件及培养基补料对积累的影响。
研究路线图
核心内容
本研究在酿酒酵母中利用双向GAL1-10启动子系统，组合表达来自Cupriavidus necator的PHB合成途径三个基因（β-酮硫解酶、乙酰乙酰-CoA还原酶和PHB合酶），系统考察前体通路逐步完善对PHB合成的影响。仅表达PHB合酶时，PHB含量仅约0.2%细胞干重；加入还原酶后含量提高约18倍至约3.5%细胞干重；三者共表达时进一步达到约9%细胞干重，比单酶菌株高45倍，最大比合成速率也由0.06提升至2.45 mg PHB/g residual biomass/h。厌氧条件下该菌株仍可积累约3.5%细胞干重的PHB，同时产乙醇约4.5 g/L，首次证明酿酒酵母能在无氧条件下同时生产PHB和乙醇。添加乙酸（0.5 g/L）和泛酸（1000 μg/L）可使PHB产量再提高约45%。荧光显微观察显示PHB积累存在显著细胞异质性，部分细胞PHB超过细胞体积的50%。结果表明外源前体通路的逐步完善能大幅增强真核宿主PHB合成能力，为利用酿酒酵母生产生物塑料及研究酵母代谢库提供了可行平台。
创新点
['构建基于双向GAL1-10启动子的多基因共表达系统，简化真核宿主中的多基因操作。', '通过逐步增加PHB前体途径基因，使PHB积累量比仅表达合酶提高45倍。', '首次证明酿酒酵母可在厌氧条件下同时生产PHB和乙醇。', '利用尼罗红染色和荧光显微镜揭示了PHB积累的显著细胞异质性，部分细胞PHB超过细胞体积50%。', '发现乙酸和泛酸补料可进一步提高PHB产量约45%。']
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae | PHB合成途径 | phaA | Beta-ketothiolase | 催化 | 催化两分子乙酰-CoA缩合生成乙酰乙酰-CoA |
| Saccharomyces cerevisiae | PHB合成途径 | phaB | Acetoacetyl-CoA reductase | 催化 | 催化乙酰乙酰-CoA还原为(R)-3-羟基丁酰-CoA |
| Saccharomyces cerevisiae | PHB合成途径 | phaC | PHB synthase | 催化 | 聚合(R)-3-羟基丁酰-CoA生成PHB |
| Saccharomyces cerevisiae | 半乳糖利用 | GAL1/GAL10 | — | 调控 | 双向GAL1-10启动子用于诱导PHB途径基因的共表达 |
关键发现
- 仅表达PHB合酶（菌株S）时PHB含量约0.2%细胞干重（CDW）；共表达合酶和还原酶（菌株RS）后PHB含量提高约18倍至约3.5% CDW；三者共表达（菌株RKS）时PHB含量达到约9% CDW，比菌株S高45倍。最大比PHB合成速率分别为：菌株S
- 06 mg PHB/g residual biomass/h，菌株RS
- 18 mg PHB/g residual biomass/h，菌株RKS
- 45 mg PHB/g residual biomass/h。厌氧条件下，菌株RKS的PHB含量约3.5% CDW，乙醇终浓度约4.5 g/L，比PHB产率0.37 mg PHB/g CDW/h。添加乙酸（0.5 g/L）和泛酸（1000 μg/L）使PHB产量提高约45%。菌株RKS在PHB积累开始时约70%细胞同时携带两种质粒，实验结束时约45%。荧光显微显示部分细胞PHB含量超过细胞体积的50%，而其他细胞无PHB。
研究结论
通过外源表达Cupriavidus necator的PHB合成途径基因，可显著增强酿酒酵母的PHB合成能力，使其能够好氧和厌氧地积累PHB，并与乙醇共生产。该策略为利用酿酒酵母生产生物塑料提供了可行基础，PHB系统也可作为研究酵母体内代谢物库的探针。