Enhancement of pyruvate productivity in Torulopsis glabrata: Increase of NAD+ availability
- 作者
- Liming Liu, Yin Li, Zhongping Shi, Guocheng Du, Jian Chen
- 单位
- The Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology, Southern Yangtze University, 170 Huihue Road, Wuxi 214036, PR China
- 杂志
- Journal of Biotechnology（2006）
- DOI
- 10.1016/j.jbiotec.2006.04.014
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在低溶解氧条件下，Torulopsis glabrata中NADH不能完全氧化再生为NAD+，导致NAD+供应不足，限制了糖酵解通量和丙酮酸生产率。
研究策略
通过补充烟酸（NA）作为NAD+前体提高细胞内NAD+水平；并通过诱变筛选乙醇脱氢酶（ADH）活性提高的突变株，同时添加乙醛作为外源电子受体，促进NADH向NAD+的氧化，提高NAD+的可用性。
研究路线图
核心内容
针对Torulopsis glabrata在低溶解氧条件下NADH再生受阻、NAD+供应不足从而限制丙酮酸生产的问题，该研究采用双管齐下的策略提升细胞内NAD+可用性。一方面，通过补充NAD+前体烟酸提高其绝对水平，8 mg/L烟酸使葡萄糖消耗率和丙酮酸浓度分别较对照提高48.4%和29%；另一方面，诱变筛选获得ADH活性较亲本提升约110%的突变株WSH-13，并添加乙醛作为外源电子受体促进NADH氧化再生NAD+。对该突变株添加4 mg/L乙醛后，葡萄糖消耗率和丙酮酸产量分别提高26.3%和22.5%，NADH/NAD+比从0.46降至0.22。在DO 20%条件下维持乙醛供给，丙酮酸生产速率、产率和浓度分别提升68%、44%和45%，同时糖酵解关键酶PFK、GAPDH和PK活性分别提高23.1%、13.5%和7.89%。该策略在低DO条件下实现了高丙酮酸浓度、产率与生产率的同步提升，且无甘油副产物，为通过增强辅因子再生推动酵母代谢物生产提供了可行替代路径。
创新点
首次采用提高ADH活性并添加乙醛作为外源电子受体的策略，在低DO条件下同时实现高丙酮酸浓度、高产率和高生产率，且不产生甘油副产物。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Torulopsis glabrata CCTCC M202019 | 糖酵解/丙酮酸代谢 | — | 乙醇脱氢酶 (ADH) | 催化 | 野生型菌株，ADH活性较低，不能利用乙醇作为唯一碳源。 |
| Torulopsis glabrata WSH-13 | 糖酵解/NAD+再生 | — | 乙醇脱氢酶 (ADH) | 催化 | 经NTG诱变筛选的突变株，ADH活性比亲本提高约110%，能利用乙醇为唯一碳源（1.8 g/L DCW），用于添加乙醛促进NADH氧化。 |
| Torulopsis glabrata | 丙酮酸代谢 | — | 丙酮酸脱羧酶 (PDC) | 催化 | 活性有限，导致在低DO下NADH不能通过发酵途径充分氧化，需借助ADH和乙醛。 |
| Torulopsis glabrata | 糖酵解 | — | 磷酸果糖激酶 (PFK) | 催化 | 低DO下添加乙醛后比活力提高23.1%。 |
| Torulopsis glabrata | 糖酵解 | — | 甘油醛-3-磷酸脱氢酶 (GAPDH) | 催化 | 低DO下添加乙醛后比活力提高13.5%。 |
| Torulopsis glabrata | 糖酵解 | — | 丙酮酸激酶 (PK) | 催化 | 低DO下添加乙醛后比活力提高7.89%。 |
关键发现
- 补充8 mg/L烟酸使葡萄糖消耗率和丙酮酸浓度分别提高48.4%和29%（相对4 mg/L对照）
- 筛选的突变株WSH-13的ADH活性比亲本提高约110%，能以乙醇为唯一碳源生长（1.8 g/L DCW）
- 对突变株添加4 mg/L乙醛后，葡萄糖消耗率和丙酮酸产量分别提高26.3%和22.5%，NADH/NAD+比从0.46降至0.22
- 在DO 20%条件下，维持4 mg/L乙醛使丙酮酸生产速率、丙酮酸产率和浓度分别比对照提高68%、44%和45%，同时细胞内ATP水平降低12.6%，NADH/NAD+比降低63.9%
- 低DO下添加乙醛还使PFK、GAPDH和PK活性分别提高23.1%、13.5%和7.89%。
研究结论
通过增加NAD+可用性显著提高了T. glabrata的糖酵解通量和丙酮酸生产率，为酵母代谢物生产提供了一种替代策略。