Phenotypes and fed-batch fermentation of ubiquitous-overproducing fission yeast using ppt1 gene
- 作者
- Dawei Zhang, Binaya Shrestha, Weining Niu, Pingfang Tian, Tianwei Tan
- 单位
- Beijing Key Lab of Bioprocess, College of Biology Science and Technology, Beijing University of Chemical Technology, Beijing 100029, China
- 杂志
- Journal of Biotechnology（2006）
- DOI
- 10.1016/j.jbiotec.2006.09.012
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
如何通过过表达ppt1基因提高裂殖酵母中泛醌-10（辅酶Q10）的产量，并考察其表型变化及实现大规模高细胞密度发酵。
研究策略
克隆全长ppt1基因（MTppt1）并构建内质网定位的ERppt1基因，分别转化裂殖酵母，比较泛醌含量；测试重组酵母对氧化、盐、低温等胁迫的耐受性；采用在线乙醇浓度和呼吸商（RQ）反馈控制葡萄糖流加，进行补料分批高细胞密度发酵。
研究路线图
核心内容
该研究通过克隆裂殖酵母的ppt1基因（编码4-羟基苯甲酸聚异戊二烯转移酶），分别构建了靶向线粒体的MTppt1和靶向内质网的ERppt1过表达菌株，以探究不同亚细胞定位对泛醌-10（辅酶Q10）合成的影响。结果显示，过表达MTppt1和ERppt1使泛醌含量分别提高3.7倍和5.1倍，提示内质网定位策略优于线粒体，且泛醌合成可发生于内质网。重组酵母对3 mM H2O2、2 mM Cu2+、200 mM NaCl及22°C低温均表现出强于野生型的耐受性，表明过量合成泛醌增强了胁迫抗性。进一步采用在线乙醇浓度和呼吸商（RQ）反馈控制葡萄糖流加进行补料分批发酵，经87.5小时后最大生物量达56.5 g DCW/L，泛醌-10产量达23.17 mg/L，最大比含量0.42 mg/g（60 h），RQ维持在1–1.2，乙醇浓度控制在2–3 g/L。该工作不仅通过亚细胞定位优化显著提升了泛醌产量，还建立了高细胞密度补料分批发酵工艺，为泛醌-10的大规模生产提供了可行途径。
创新点
首次将PPT1分别靶向线粒体和内质网，发现ER定位使泛醌含量提高5.1倍，高于线粒体定位的3.7倍，提示泛醌合成可发生于内质网；发现泛醌过量合成酵母对H2O2、Cu2+、NaCl和低温具有更强耐受性；通过在线乙醇浓度和RQ反馈控制实现裂殖酵母高细胞密度补料分批发酵。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Schizosaccharomyces pombe (SPQ-01 Leu-) | 泛醌生物合成途径 | ppt1 (MTppt1) | 4-羟基苯甲酸聚异戊二烯转移酶 (PPT1) | 催化 | 全长ppt1基因，天然线粒体定位信号，催化4-羟基苯甲酸与聚异戊二烯侧链缩合，为泛醌合成限速步骤 |
| Schizosaccharomyces pombe (SPQ-01 Leu-) | 泛醌生物合成途径 | ERppt1 (截短ppt1融合BiP ER信号肽和ADEL滞留信号) | 内质网定位的PPT1蛋白 | 区室化 | 去除天然线粒体信号肽，融合BiP ER信号肽和ADEL ER滞留信号，靶向内质网，使泛醌含量提高5.1倍 |
关键发现
- 过表达MTppt1和ERppt1使裂殖酵母泛醌-10含量分别提高3.7倍和5.1倍
- 重组酵母在3 mM H2O2、2 mM Cu2+、200 mM NaCl及22°C低温条件下生长快于野生型。补料分批发酵经87.5小时后，最大生物量达56.5 g DCW/L（摘要为57 g/L），泛醌-10产量达23.17 mg/L（摘要为23 mg/L），最大比含量0.42 mg/g（60 h），RQ维持在1-1.2，乙醇浓度控制在2-3 g/L。
研究结论
过表达ppt1基因可显著提高裂殖酵母泛醌-10产量，且ER定位策略优于线粒体定位；高泛醌含量赋予酵母更强的抗氧化、耐盐和耐冷能力。通过在线乙醇浓度和RQ反馈控制的补料分批发酵实现了高细胞密度（约57 g/L）和高泛醌产量（约23 mg/L），为泛醌-10的大规模生产提供了可行工艺。