Sorbitol co-feeding reduces metabolic burden caused by the overexpression of a Rhizopus oryzae lipase in Pichia pastoris
- 作者
- Ramón Ramón, Pau Ferrer, Francisco Valero
- 单位
- Departament d'Enginyeria Química, ETSE, Universitat Autònoma de Barcelona
- 杂志
- Journal of Biotechnology（2007）
- DOI
- 10.1016/j.jbiotec.2007.02.025
- 所属领域
- 发酵工程
- 关键词
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解决的核心问题
毕赤酵母过表达Rhizopus oryzae脂肪酶（ROL）引发严重代谢负担和未折叠蛋白反应，导致细胞生长减缓、比生产速率骤降，尤其在使用甲醇为唯一碳源时，MutS表型及多拷贝菌株甚至无法持续生长。
研究策略
在批次和补料分批培养中采用山梨醇/甲醇混合碳源替代甲醇单一碳源，比较不同Mut表型（Mut+和MutS）菌株的生长与异源蛋白生产效率。
核心内容
本研究针对毕赤酵母过表达Rhizopus oryzae脂肪酶（ROL）引发的代谢负担与未折叠蛋白反应问题，提出以山梨醇/甲醇混合碳源替代甲醇单一碳源的培养策略。作者系统比较了Mut+与MutS两种甲醇利用表型菌株在批次和补料分批培养中的生长与产酶表现。结果显示，批次培养中MutS单拷贝菌株在混合碳源下脂肪酶活性达53 UA/ml，较Mut+菌株以甲醇为唯一碳源时的6.1 UA/ml提高8.7倍；MutS菌株能同步消耗两种底物，而Mut+菌株顺序消耗，且山梨醇共同化使MutS多拷贝菌株突破甲醇单一碳源下无法生长的瓶颈。补料分批培养中，山梨醇共投喂使最大脂肪酶活性达380 UA/ml，较仅用甲醇的137 UA/ml提高2.8倍，体积生产率提升至4285 UA/L/h，平均比生长速率提高4倍，同时避免了诱导后期比生产速率的骤降。研究表明，山梨醇共投喂通过缓解ROL分泌瓶颈和改善能量状态，显著提升了MutS菌株的异源蛋白生产效率，为减轻毕赤酵母代谢负担提供了有效策略。
创新点
['首次系统比较Mut+与MutS表型在甲醇/山梨醇混合底物批次培养中的底物消耗规律，发现MutS菌株同步消耗两种底物而Mut+菌株顺序消耗。', '证明山梨醇共投喂可显著提高MutS菌株的ROL产量和比生长速率，并避免诱导后期比生产速率的急剧下降。', '揭示山梨醇共投喂能够使MutS多拷贝ROL菌株在批次培养中维持生长和产酶，而甲醇单一碳源下该菌株无法生长。']
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Pichia pastoris X-33 (Mut+) | 甲醇利用途径 | ROL | Rhizopus oryzae lipase (ROL) | 催化 | 异源表达的单拷贝ROL菌株，分泌表达目标脂肪酶 |
| Pichia pastoris KM71 (Muts) | 甲醇利用途径 | ROL | Rhizopus oryzae lipase (ROL) | 催化 | AOX1基因敲除（aox1Δ::SARG4 AOX2）导致的甲醇利用缓慢表型，含单拷贝或多拷贝ROL基因 |
| Pichia pastoris | 甲醇利用途径 | AOX1 | 醇氧化酶1 (AOX1) | 催化 | AOX1启动子驱动ROL表达，甲醇为诱导底物 |
| Pichia pastoris | 碳代谢 | — | — | 能量供给 | 山梨醇作为非阻遏碳源，与甲醇共投喂提供能量并维持细胞生长，减轻异源蛋白表达造成的代谢负担 |
关键发现
- ['批次培养中，MutS单拷贝菌株在甲醇/山梨醇混合底物下脂肪酶活性达53 UA/ml，较Mut+菌株以甲醇为唯一碳源时的6.1 UA/ml提高8.7倍
- Mut+菌株混合底物下仅为10.4 UA/ml（1.7倍）。', 'MutS菌株在混合底物培养中同时消耗甲醇和山梨醇，获得更高比生长速率和分泌水平
- Mut+菌株则顺序消耗两种底物。', 'MutS多拷贝菌株在混合底物批次培养中可生长并产酶，最大脂肪酶活性29.5 UA/ml，但比单拷贝菌株低1.8倍，体积和比生产率分别低2.9倍和2.4倍。', '补料分批培养（甲醇设定点0.5 g/l）中山梨醇共投喂使最大脂肪酶活性达380 UA/ml，比仅用甲醇（137 UA/ml）提高2.8倍
- 体积生产率由1996提高到4285 UA/l/h（2.15倍），比生产率由57提高到99 UA/gX/h（1.74倍），平均比生长速率由0.003 h^-1提高到0.012 h^-1（4倍），平均比生产速率由58提高到165 UA/gX/h（2.8倍）。', '山梨醇共投喂使比生产速率在诱导后保持在约125 UA/gX/h（50-70 h），未出现甲醇单一碳源时的急剧下降。', 'MutS菌株胞内脂肪酶活性比Mut+高2倍，但胞外活性高5.1倍，表明山梨醇共同化缓解了ROL分泌瓶颈。']
研究结论
山梨醇共投喂是一种有效缓解毕赤酵母ROL过表达代谢负担的策略。在MutS菌株中，甲醇/山梨醇混合底物可实现同步消耗，显著提高异源蛋白产量和生产率，并避免甲醇单一碳源诱导后比生产速率的骤降。此外，山梨醇共投喂使MutS多拷贝菌株能够持续生长和产酶，表明细胞应激反应与能量状态密切相关。