Carotenoid accumulation in bacteria with enhanced supply of isoprenoid precursors by upregulation of exogenous or endogenous pathways
- 作者
- Antía Rodríguez-Villalón, Jordi Pérez-Gil, Manuel Rodríguez-Concepción
- 单位
- Departament de Bioquímica i Biologia Molecular, Facultat de Biologia, Universitat de Barcelona; Laboratori de Genètica Molecular Vegetal, Consorci CSIC-IRTA
- 杂志
- Journal of Biotechnology（2008）
- DOI
- 10.1016/j.jbiotec.2008.02.023
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
非类胡萝卜素生产菌大肠杆菌中类胡萝卜素（番茄红素）产量受异戊二烯前体（IPP和DMAPP）供应不足的限制，需要比较增强内源MEP途径与外源MVA途径对前体供应的效果。
研究策略
构建携带番茄红素合成质粒pLYC（crtE/crtB/crtI）的大肠杆菌菌株，分别通过IPTG诱导的pTAC-DXS质粒过表达内源dxs基因，或通过阿拉伯糖诱导的MVA+操纵子（yMVK/hPMK/yPMD/idi）利用外源甲羟戊酸（MVA）补充前体，在不同诱导物浓度和不同宿主背景下测定细胞生长和番茄红素积累。
核心内容
本研究以大肠杆菌为宿主，系统比较了增强内源MEP途径与外源MVA途径对番茄红素积累的差异。作者构建携带番茄红素合成质粒pLYC的菌株，分别通过IPTG诱导过表达内源dxs基因，或通过阿拉伯糖诱导的MVA+操纵子利用外源甲羟戊酸补充异戊二烯前体。结果显示，无IPTG时DXS过表达使番茄红素产量增加8倍，最高达80 mg/L，但添加IPTG反而抑制生长和产量。而通过MVA+操纵子补充前体效果更为显著，在0.1%阿拉伯糖和25 mM甲羟戊酸条件下，EcAB4-1菌株产量比无MVA时提高10倍。进一步将MVA+操纵子整合至BL21(DE3)背景的EcAM5-1菌株后，产量再次提升2倍，最终达到228 mg/L，比无MVA的EcAB4-1 pLYC细胞高20倍。研究还发现高浓度阿拉伯糖（>0.1%）抑制生长和产量，高浓度甲羟戊酸在稳定期轻微抑制生长。结果表明外源MVA途径在补充前体方面优于内源MEP途径，但宿主菌株背景、诱导剂浓度和蛋白表达水平同样对最终产量有显著影响。
创新点
系统比较了内源MEP途径（DXS过表达）与外源MVA途径（MVA+操纵子）对番茄红素产量的影响；发现低浓度阿拉伯糖（0.1%）和高浓度MVA（25 mM）可显著提高产量；首次在BL21(DE3)背景中整合MVA+操纵子，实现最高228 mg/L的番茄红素产量。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli K12 MG1655 (EcAB4-1) | MEP途径 | dxs | DXS (1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase) | 催化 | 过表达内源dxs增强MEP途径前体供应，无IPTG时番茄红素产量增加8倍，最高80 mg/L |
| EcAB4-1 | 外源MVA途径 | yMVK, hPMK, yPMD, idi | 甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶、IPP/DMAPP异构酶 | 催化 | MVA+操纵子，将外源MVA转化为IPP和DMAPP，补充MVA使产量提高10倍 |
| EcAB4-1 | 番茄红素合成途径 | crtE, crtB, crtI | GGPP合酶(CrtE)、八氢番茄红素合酶(CrtB)、八氢番茄红素脱氢酶(CrtI) | 催化 | 来自Erwinia uredovora，利用pLYC质粒表达，将IPP/DMAPP转化为番茄红素 |
| Escherichia coli BL21(DE3) (EcAM5-1) | 外源MVA途径和番茄红素合成途径 | MVA+操纵子(yMVK,hPMK,yPMD,idi), crtE, crtB, crtI | 甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶、IPP/DMAPP异构酶、GGPP合酶、八氢番茄红素合酶、八氢番茄红素脱氢酶 | 催化 | BL21(DE3)背景整合MVA+操纵子，携带pLYC质粒，产量较EcAB4-1提高2倍，最高228 mg/L |
关键发现
- 在EcAB4-1 pLYC细胞中，无IPTG时pTAC-DXS过表达使番茄红素产量增加8倍，最高达80 mg/L
- 添加IPTG则抑制生长和产量。通过MVA+操纵子补充MVA，在0.1%阿拉伯糖和1 mM MVA条件下产量提高10倍
- 提高MVA浓度至25 mM时，EcAB4-1 pLYC产量达到最高，且比无MVA时高10倍。使用BL21(DE3)背景的EcAM5-1菌株后，产量再增加2倍，在25 mM MVA下达到228 mg/L，比无MVA的EcAB4-1 pLYC细胞高20倍。高浓度阿拉伯糖（>0.1%）抑制生长和产量，高浓度MVA（5 mM）在稳定期轻微抑制生长。
研究结论
外源MVA途径比内源MEP途径更有利于提高大肠杆菌中番茄红素的积累，但除了前体供应，宿主菌株背景、诱导剂浓度和蛋白表达水平等因素也显著影响最终产量。