Metabolic engineering of ketocarotenoids biosynthesis in the unicellular microalgae Chlamydomonas reinhardtii
- 作者
- Rosa León, Inmaculada Couso, Emilio Fernández
- 单位
- Departamento de Química y Ciencia de Materiales, Facultad de Ciencias Experimentales, Universidad de Huelva; Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Campus de Rabanales, Universidad de Córdoba
- 杂志
- Journal of Biotechnology（2007）
- DOI
- 10.1016/j.jbiotec.2007.03.005
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
大多数高等植物和微藻不能合成酮类胡萝卜素（如虾青素、角黄素），如何在真核微藻莱茵衣藻中通过代谢工程实现酮类胡萝卜素的合成。
研究策略
从雨生红球藻（Haematococcus pluvialis）克隆β-胡萝卜素酮醇酶基因bkt1，构建由衣藻组成型启动子RbcS2驱动的表达载体，分别融合Rubisco小亚基（RbcS2）或铁氧还蛋白（Fd）的转运肽序列，通过玻璃珠法转化莱茵衣藻，筛选阳性转化株并分析类胡萝卜素组成。
核心内容
本研究从雨生红球藻中克隆了β-胡萝卜素酮醇酶基因bkt1，并将其分别与Rubisco小亚基（RbcS2）或铁氧还蛋白（Fd）的转运肽序列融合，置于莱茵衣藻组成型启动子RbcS2驱动下，通过玻璃珠法转化莱茵衣藻，以期在该真核微藻中实现酮类胡萝卜素的异源合成。结果显示，约40%（RbcS2-tp）和31%（Fd-tp）的巴龙霉素抗性转化株整合了外源基因，所有含bkt1的转化株均产生一种HPLC保留时间约8.4 min、MS主峰m/z 583.4的新色素，鉴定为4-酮基叶黄素或其异构体酮基玉米黄素，含量约为20 μg g^-1 DW，仅占叶黄素含量的0.75%，而野生型及对照组均无此产物。该研究首次在真核微藻中实现了类胡萝卜素合成途径的基因操作，证明外源酮醇酶可在莱茵衣藻中功能表达并产生新类胡萝卜素，但产量极低，表明底物可及性和类胡萝卜素合成酶复合体的整合是主要限制因素，后续需通过调控机制研究来提升产量。
创新点
首次在真核微藻中实现对类胡萝卜素合成途径的基因操作；证明外源类胡萝卜素合成酶基因可在莱茵衣藻中表达并产生新类胡萝卜素（酮基叶黄素）；比较了不同来源β-胡萝卜素酮醇酶基因的密码子使用差异。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Chlamydomonas reinhardtii（莱茵衣藻） | 类胡萝卜素合成途径 | bkt1 | β-胡萝卜素酮醇酶（BKT1） | 催化 | 来自雨生红球藻，在衣藻中表达产生4-酮基叶黄素 |
| Escherichia coli（大肠杆菌） | β-胡萝卜素合成途径（pACCAR16ΔcrtX） | bkt1 | β-胡萝卜素酮醇酶（BKT1） | 催化 | 功能互补实验，将β-胡萝卜素转化为角黄素和痕量海胆酮 |
| Chlamydomonas reinhardtii（莱茵衣藻） | 叶绿体蛋白转运 | rbcS2（转运肽编码序列） | Rubisco小亚基转运肽（RbcS2-tp） | 区室化 | 引导BKT1蛋白进入叶绿体 |
| Chlamydomonas reinhardtii（莱茵衣藻） | 叶绿体蛋白转运 | fd（转运肽编码序列） | 铁氧还蛋白转运肽（Fd-tp） | 区室化 | 引导BKT1蛋白进入叶绿体类囊体腔 |
| Chlamydomonas reinhardtii（莱茵衣藻） | 抗生素抗性筛选 | aphVIII | 氨基糖苷3'-磷酸转移酶 | 催化 | 来自Streptomyces rimosus，赋予巴龙霉素抗性，用于筛选转化株 |
关键发现
- 从雨生红球藻分离的bkt1 cDNA（GenBank X86782）在大肠杆菌中功能互补产生角黄素及痕量海胆酮
- 经RbcS2或Fd转运肽引导的bkt1转化莱茵衣藻后，约40%（RbcS2-tp）和31%（Fd-tp）的巴龙霉素抗性转化株基因组整合了外源基因
- 所有含bkt1的转化株均检测到具有典型酮类胡萝卜素光谱的新色素，HPLC保留时间约8.4 min，MS主要峰m/z 583.4（M+H），鉴定为4-酮基叶黄素（ketolutein）或其异构体酮基玉米黄素
- 新酮类胡萝卜素含量约为叶黄素含量的0.75%，约20 μg g^-1 DW
- 在野生型衣藻及所有对照组中未检测到酮类胡萝卜素。
研究结论
在莱茵衣藻中表达外源类胡萝卜素合成基因并产生亲本菌株不具备的新类胡萝卜素是可行的，但酮类胡萝卜素产量很低（约20 μg g^-1 DW），主要限制可能是底物可及性和类胡萝卜素合成酶复合体的整合问题；需要进一步研究调控机制以提高产量。