Expression of xyloglucan endotransglycosylases of Gerbera hybrida and Betula pendula in Pichia pastoris
- 作者
- Jaana H. Toikkanen, Marja-Leena Niku-Paavola, Michael Bailey, Juha Immanen, Eija Rintala, Paula Elomaa, Yrjo Helariutta, Teemu H. Teeri, Richard Fagerström
- 单位
- VTT, Technical Research Centre of Finland; Department of Applied Biology, University of Helsinki; Institute of Biotechnology, University of Helsinki; Department of Biology, University of Turku
- 杂志
- Journal of Biotechnology（2007）
- DOI
- 10.1016/j.jbiotec.2007.03.004
- 所属领域
- 发酵工程
- 关键词
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解决的核心问题
植物木葡聚糖内转糖苷酶（XET）在异源表达系统中产量低、加工不完全，难以获得足量活性酶用于应用。
研究策略
从Gerbera hybrida和Betula pendula的cDNA文库中克隆XET基因，利用α交配因子信号肽在毕赤酵母中分泌表达；通过降低培养温度（22°C）和采用温度限制补料分批（TLFB）发酵工艺提高蛋白正确加工和产量。
核心内容
该研究从非洲菊和白桦的cDNA文库中克隆了两个新的木葡聚糖内转糖苷酶基因GXET和BXET，并在毕赤酵母GS115中利用α交配因子信号肽实现分泌表达。针对植物XET异源表达产量低、加工不完全的问题，通过降低培养温度至22°C显著改善了前导肽加工效率，摇瓶条件下仅在22°C检测到GXET活性，且主要产物为正确大小的蛋白（GXET约38 kDa，BXET约39 kDa）。进一步在生物反应器中采用温度限制补料分批发酵策略，BXET在富集培养基中最大活性达1,527,200 cps/ml，产量约60-70 mg/L，较摇瓶最佳克隆活性（92,487 cps/ml）提升超过16倍。BXET酶学性质与已知植物XET相似，最适pH约6、最适温度约30°C，但热稳定性较差（30°C下半衰期仅30分钟），1 mM DTT可提高活性30%。该工作证明低温发酵结合TLFB补料策略能有效提升植物XET在毕赤酵母中的分泌产量，为这类难以表达的植物糖苷水解酶提供了可行的异源生产方案。
创新点
1. 首次报道G. hybrida和B. pendula两个新XET基因的分离及其在毕赤酵母中的分泌表达；2. 发现低温（22°C）培养显著改善α交配因子前导肽的加工效率和XET活性；3. 应用TLFB补料策略在生物反应器中显著提高BXET产量，活性达1,527,200 cps/ml，产量约60-70 mg/L。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Pichia pastoris GS115 | 木葡聚糖代谢 | GXET | GXET | 催化 | 源自Gerbera hybrida的木葡聚糖内转糖苷酶，通过α交配因子信号肽分泌表达，N端带c-myc和His标签。 |
| Pichia pastoris GS115 | 木葡聚糖代谢 | BXET | BXET | 催化 | 源自Betula pendula的木葡聚糖内转糖苷酶，与杨树PttXET16A一致性87.5%，在富集培养基TLFB中产量最高。 |
| Pichia pastoris GS115 | 甲醇代谢 | AOX1 | 醇氧化酶1启动子 | 调控 | 甲醇诱导型启动子，驱动XET基因在毕赤酵母中表达。 |
| Pichia pastoris GS115 | 蛋白质分泌途径 | MFα | 交配因子α前导肽 | 转运 | 引导XET蛋白分泌至胞外培养基，低温下加工更完全。 |
关键发现
- GXET和BXET氨基酸序列一致性为51%
- 摇瓶培养中22°C优于30°C，22°C时主要产物为正确大小蛋白（GXET约38 kDa，BXET约39 kDa），且22°C时才检测到GXET活性
- 最佳GXET克隆活性为2,413 cps/ml，最佳BXET克隆活性为92,487 cps/ml（比GXET高近40倍）
- 生物反应器中GXET最大活性为20,606 cps/ml（甲醇限制补料，最小培养基），BXET在最小培养基TLFB中最大活性为408,920 cps/ml，在富集培养基TLFB中最大活性为1,527,200 cps/ml
- BXET产量估算为60-70 mg/L
- BXET最适pH约为6，最适温度约30°C，30°C下半衰期仅30分钟
- 1 mM DTT使BXET活性提高30%，1 M CaCl2使活性降低55%。
研究结论
通过低温培养和TLFB补料策略，成功在毕赤酵母中高效分泌表达两种植物XET，其中BXET产量高达60-70 mg/L，且酶学性质与已知植物XET相似，表明毕赤酵母是生产植物XET的有效宿主。