A high-throughput and single-tube recombination of crude PCR products using a DNA polymerase inhibitor and type IIS restriction enzyme
- 作者
- Ippei Kotera, Takeharu Nagai
- 单位
- PRESTO, Japan Science and Technology Agency; Laboratory for Nanosystems Physiology, Research Institute for Electronic Science, Hokkaido University
- 杂志
- Journal of Biotechnology（2008）
- DOI
- 10.1016/j.jbiotec.2008.07.1816
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
开发一种简单、快速、高效的DNA重组方法，能够直接从粗PCR产物中一步组装多个DNA片段，避免传统克隆中的凝胶纯化和多步骤操作。
研究策略
利用IIS型限制性内切酶切割位点与识别位点分离的特点，设计PCR引物，使扩增片段末端带有特定的切割位点和识别位点。在同一反应管中同时加入IIS型内切酶和DNA连接酶，通过酶切和连接的平衡驱动定向重组。加入aphidicolin抑制残留的KOD DNA聚合酶活性，加入DpnI消化模板DNA，从而允许粗PCR产物直接使用。
核心内容
该研究报道了一种名为FASTR的高通量单管DNA重组方法，能够直接从粗PCR产物中快速组装多个片段。其核心策略是利用IIS型限制性内切酶切割位点与识别位点分离的特性设计引物，使扩增片段末端携带特定酶切位点，并在同一反应管中同时加入IIS型内切酶（Lgul）和T4 DNA连接酶，通过酶切-连接的动态平衡实现定向重组。为允许粗PCR产物直接使用，体系中加入aphidicolin抑制残留的KOD DNA聚合酶活性，并用DpnI消化模板DNA，省去凝胶纯化步骤。结果显示，FASTR在15分钟内即可获得超过50%的阳性克隆，2小时重组效率接近80%；双片段（mSECFP+mVenus）重组效率为49.24%，三片段（+mCherry）为20.66%。利用该方法优化FRET探针，最佳克隆的FRET效率达到67%。FASTR将重组克隆的高效率与传统克隆的灵活性结合，全流程操作少于15分钟，适用于高通量DNA组装和大量组合构建场景，为合成生物学中的快速克隆提供了一种简便实用的工具。
创新点
1. 首次报道了IIS型限制性内切酶与连接酶在同一管内自发、定向的DNA重组；2. 加入aphidicolin和DpnI实现了粗PCR产物的直接重组，无需纯化；3. 步骤简单，全部操作少于15分钟，适合高通量。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli (JM109 DE3) | — | Lgul | Lgul type IIS restriction endonuclease | 催化 | 切割DNA，产生自定义粘性末端 |
| Escherichia coli (JM109 DE3) | — | DpnI | DpnI restriction enzyme | 催化 | 选择性消化模板DNA |
| Escherichia coli (JM109 DE3) | — | T4 DNA ligase | T4 DNA ligase | 催化 | 连接DNA片段 |
| Escherichia coli (JM109 DE3) | — | KOD-plus | KOD-plus DNA polymerase | 催化 | 用于PCR扩增，来自Pyrococcus kodakaraensis |
关键发现
- FASTR反应在15分钟内即可获得超过50%的阳性克隆（荧光菌落）
- 2小时重组效率接近80%。双片段重组（mSECFP+mVenus）效率为49.24%，三片段（+mCherry）为20.66%。利用FASTR优化FRET探针，获得最佳克隆的FRET效率为67%。
研究结论
FASTR技术是一种快速、高效、灵活的DNA重组方法，结合了重组克隆的高效率和传统克隆的灵活性，特别适用于高通量DNA操作和需要大量组合构建的应用，如FRET探针优化。