高级醇 · 代谢工程文献库

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Production of santalenes and bergamotene in Nicotiana tabacum plants

作者
Jun-Lin Yin, Woon-Seng Wong
单位
YMU-HKBU Joint Laboratory of Traditional Natural Medicine, Yunnan Minzu University, Kunming, China; Temasek Life Sciences Laboratory, National University of Singapore, 1 Research Link, Singapore, Singapore
杂志
PLoS ONE（2019）
DOI
10.1371/journal.pone.0203249
所属领域
代谢工程
关键词
MVA pathwayMyzus persicaeNicotiana tabacumbergamotenemetabolic engineeringsantalene
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解决的核心问题

利用代谢工程在烟草中生产檀香烯和香柠檬烯，并研究其对桃蚜（Myzus persicae）的吸引作用，以评估转基因烟草作为诱捕作物防治桃蚜的潜力。

研究策略

采用叶绿体靶向（利用RTP/LTP转运肽将FPS和SaSSy定位到叶绿体）和增强细胞质甲羟戊酸（MVA）途径（共表达HMGR或tHMGR）的策略，在烟草中表达檀香烯合酶等基因，并通过GC-MS和昆虫选择实验评估产量及对桃蚜的吸引效果。

研究路线图

100%
研究问题：能否在烟草中工程化生产檀香烯/香柠檬烯并吸引桃蚜？
策略1：叶绿体靶向表达（RTP/LTP转运肽引导）
策略2：增强MVA途径（共表达HMGR/tHMGR）
策略3：共表达SaCYP76F39v1氧化酶（合成檀香醇/香柠檬醇）
关键改造：叶绿体靶向（RTP-FPS + RTP-SaSSy）
关键改造：MVA增强（HMGR/tHMGR + SaSSy）
关键改造：CYP氧化酶共表达（SaCYP76F39v1）
结果：tHMGR+SaSSy产量最高（α-檀香烯1025.8 ng/g FW）；稳定株系HS6产α-檀香烯2946.1 ng/g FW/24h；吸引桃蚜67%
结论：增强MVA途径可显著提高檀香烯产量；转基因烟草吸引桃蚜，可作诱捕作物；CYP氧化酶未检测到产物
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核心内容

本研究通过代谢工程在烟草中异源合成倍半萜类化合物檀香烯和香柠檬烯，以评估其作为诱捕作物防治桃蚜的潜力。作者比较了两种策略：利用RTP/LTP转运肽将法尼基焦磷酸合酶和檀香烯合酶靶向叶绿体，以及通过共表达全长或截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶增强细胞质甲羟戊酸途径。在本氏烟瞬时表达体系中，共表达截短HMGR与檀香烯合酶产量最高，α-檀香烯达1025.8 ng/g鲜重，β-檀香烯为885.1 ng/g鲜重。稳定转基因烟草中，共表达HMGR与檀香烯合酶的HS6株系产量最高，α-檀香烯达2946.1 ng/g鲜重/24小时，β-檀香烯为1732.3 ng/g鲜重/24小时，较单表达檀香烯合酶的对照提高500至1000倍。叶绿体靶向策略未能显著增产。昆虫行为实验显示，59.8%至67.3%的桃蚜偏好转基因植株释放的挥发物，外源处理野生型叶片亦具相似吸引效果。共表达氧化酶SaCYP76F39v1的植株中未检测到檀香醇，提示该酶在烟草中无法将檀香烯进一步羟化。研究表明增强MVA途径可高效积累檀香烯和香柠檬烯，且释放这些挥发物的转基因烟草对桃蚜有吸引力，具备作为诱捕作物的应用潜力。

创新点

1) 系统比较了叶绿体靶向与MVA途径增强策略对檀香烯/香柠檬烯产量的影响；2) 证明共表达HMGR或tHMGR可提高檀香烯和香柠檬烯产量500-1000倍；3) 首次证明释放檀香烯/香柠檬烯的转基因烟草对桃蚜有吸引力，提出诱捕作物应用。

研究对象（7）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Nicotiana tabacum 甲羟戊酸（MVA）途径 SaSSy 檀香烯合酶 (santalene synthase) 催化 来自Santalum album，催化FPP生成α-檀香烯、α-香柠檬烯、epi-β-檀香烯和β-檀香烯
Nicotiana tabacum 甲羟戊酸（MVA）途径 FPS 法尼基焦磷酸合酶 (farnesyl diphosphate synthase) 催化 来自拟南芥，催化IPP和DMAPP生成FPP
Nicotiana tabacum 甲羟戊酸（MVA）途径 HMGR 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶 (HMGR) 催化 来自拟南芥，MVA途径限速酶，全长形式
Nicotiana tabacum 甲羟戊酸（MVA）途径 tHMGR 截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶 (truncated HMGR) 催化 来自拟南芥的截短HMGR，用于增强MVA途径
Nicotiana tabacum 倍半萜生物合成 SaCYP76F39v1 檀香烯/香柠檬烯氧化酶 (santalene/bergamotene oxidase) 催化 来自Santalum album，催化檀香烯/香柠檬烯羟化为檀香醇/香柠檬醇，但实验中未检测到产物
Nicotiana tabacum 叶绿体蛋白转运 RTP Rubisco小亚基叶绿体转运肽 (RbcS transit peptide) 区室化 来自拟南芥Rubisco小亚基信号肽，用于将蛋白靶向叶绿体
Nicotiana tabacum 叶绿体蛋白转运 LTP 芳樟醇合酶叶绿体转运肽 (linalool synthase transit peptide) 区室化 来自番茄，用于叶绿体靶向，但效率低于RTP

关键发现

  1. 在本氏烟瞬时表达中，共表达tHMGR+SaSSy产量最高：α-santalene
  2. 8 ng/g FW，α-bergamotene
  3. 8 ng/g FW，epi-β-santalene
  4. 8 ng/g FW，β-santalene
  5. 1 ng/g FW；HMGR+SaSSy相应为984.8、324.1、40.5、830.0 ng/g FW。稳定转基因烟草中，HS6线（HMGR+SaSSy）产量最高：α-santalene
  6. 1 ng/g FW/24h，α-bergamotene
  7. 6，epi-β-santalene
  8. 2，β-santalene
  9. 3；tHS13线产量也较高（1125.1、114.3、207.7、1275.7 ng/g FW/24h）。与单表达SaSSy的S系相比，HMGR/tHMGR共表达使檀香烯和香柠檬烯产量提高500-1000倍。叶绿体靶向策略（RTP-FPS+RTP-SaSSy）产量并未显著提高，甚至略低于单表达SaSSy。在共表达SaCYP76F39v1的植株中未能检测到檀香醇/香柠檬醇。短时选择实验中，59.8%-63.6%的桃蚜偏好转基因烟草；长期实验中67.1%-67.3%偏好转基因烟草。外源檀香烯/香柠檬烯处理野生型叶片同样吸引桃蚜。

研究结论

通过共表达HMGR或tHMGR增强MVA途径可显著提高烟草中檀香烯和香柠檬烯的产量；释放这些挥发性倍半萜的转基因烟草对桃蚜具有吸引力，可作为诱捕作物用于桃蚜防治；但檀香烯/香柠檬烯不能被Santalum album的CYP76F39v1氧化酶进一步羟化为檀香醇/香柠檬醇。