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Expression of hepatitis B surface antigen S domain in recombinant Saccharomyces cerevisiae using GAL1 promoter

作者
Eun-Jeong Kim, Young-Kyoung Park, Hyung-Kweon Lim, Yong-Cheol Park, Jin-Ho Seo
单位
Department of Agricultural Biotechnology, Seoul National University; Mogam Biotechnology Research Institute; Center for Agricultural Biomaterials, Seoul National University
杂志
Journal of Biotechnology（2009）
DOI
10.1016/j.jbiotec.2009.03.004
所属领域
发酵工程
关键词
Fed-batch fermentationGAL1 promoterHepatitis B virus surface antigen S domainProtein disulfide isomeraseSaccharomyces cerevisiae
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解决的核心问题

如何在重组酿酒酵母中高效表达乙肝表面抗原S域（sHBsAg）蛋白，并提高其产量和正确组装能力。

研究策略

利用半乳糖诱导型GAL1启动子表达sHBsAg，共表达蛋白质二硫键异构酶（PDI）促进二硫键形成，并采用补料分批发酵策略（连续补加葡萄糖、控制半乳糖浓度）提高细胞密度和产物浓度。

研究路线图

100%
研究问题：如何在重组酿酒酵母中高效表达乙肝表面抗原S域（sHBsAg）并提高产量与组装能力
策略：采用GAL1启动子表达sHBsAg，共表达PDI促进二硫键形成
关键改造①：GAL1启动子驱动的sHBsAg表达系统
关键改造②：共表达蛋白质二硫键异构酶（PDI）
关键改造③：补料分批发酵策略（连续补加葡萄糖、控制半乳糖浓度）
结果①：单独表达sHBsAg → 4.92 g/L干重、2.21 mg/L sHBsAg
结果②：共表达PDI → 干重9.75 g/L、sHBsAg 13.3 mg/L（提高2倍和6倍）
结果③：鉴定三种分子形式（24 kDa天然、34 kDa未加工、40 kDa N-糖基化）
结果④：补料分批发酵 → 20.2 g/L干重、74.4 mg/L sHBsAg（提高4.1倍和33.7倍）
结论：GAL1启动子+PDI共表达可行，补料分批发酵为规模化生产提供方案
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核心内容

本研究在重组酿酒酵母中利用半乳糖诱导型GAL1启动子表达乙肝表面抗原S域（sHBsAg），并通过共表达蛋白质二硫键异构酶（PDI）促进二硫键形成，结合补料分批发酵策略提升产量。批量发酵中，单独表达sHBsAg的菌株获得4.92 g/L干重和2.21 mg/L sHBsAg；共表达PDI后，干重达9.75 g/L、sHBsAg浓度升至13.3 mg/L，分别提高约2倍和6倍。免疫印迹及糖苷酶处理鉴定出三种分子形式：24 kDa为天然sHBsAg，34 kDa为含MFα信号序列的未加工形式，40 kDa为N-糖基化形式。补料分批发酵中，通过连续补加600 g/L葡萄糖并控制半乳糖浓度在15-25 g/L，获得20.2 g/L干重和74.4 mg/L最大sHBsAg浓度，较无PDI批次发酵分别提高4.1倍和33.7倍。结果表明，PDI共表达显著增强蛋白产量并改变加工形式，补料分批策略有效提高细胞密度和产物浓度，为sHBsAg规模化生产提供了可行方案。

创新点

首次在酿酒酵母中采用GAL1启动子结合PDI共表达系统生产sHBsAg；通过控制半乳糖浓度的补料分批发酵实现sHBsAg产量的大幅提升；鉴定出sHBsAg的三种分子形式（24 kDa、34 kDa、40 kDa）。

研究对象（4）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Saccharomyces cerevisiae 2805 半乳糖代谢 GAL1启动子 — 调控 半乳糖诱导型启动子，用于控制sHBsAg和pdi1基因表达
Saccharomyces cerevisiae 2805 蛋白折叠与二硫键形成 pdi1 蛋白质二硫键异构酶（PDI） 催化 共表达PDI促进sHBsAg二硫键正确形成，提高产物产量和加工效率
Saccharomyces cerevisiae 2805 乙肝表面抗原合成 sHBsAg（HBsAg S域基因） sHBsAg（乙肝表面抗原S蛋白） 区室化 目标产物，可组装成22nm颗粒；存在24kDa天然、34kDa含MFα信号序列、40kDa N-糖基化三种形式
Saccharomyces cerevisiae 2805 蛋白分泌 MFα信号序列 MFα因子信号肽 转运 引导sHBsAg进入分泌途径，部分未被切割导致34kDa和40kDa形式

关键发现

  1. 批量发酵中，单独表达sHBsAg的菌株（S. cerevisiae 2805/pBMFα-sHBsAg）获得4.92 g/L干重和2.21 mg/L sHBsAg
  2. 共表达PDI后，干重达9.75 g/L、sHBsAg浓度达13.3 mg/L，分别提高2倍和6倍
  3. 免疫印迹和糖苷酶处理表明，24 kDa为天然sHBsAg、34 kDa为含MFα信号序列的未加工形式、40 kDa为N-糖基化MFα信号序列形式
  4. 补料分批发酵中，通过连续补加600 g/L葡萄糖并控制半乳糖浓度在15-25 g/L，获得20.2 g/L干重和74.4 mg/L最大sHBsAg浓度，分别比无PDI的批次发酵提高4.1倍和33.7倍。

研究结论

在酿酒酵母中利用GAL1启动子表达sHBsAg，共表达PDI能显著提高产量并改变蛋白加工形式；补料分批发酵策略有效提高细胞密度和产物浓度，为sHBsAg的规模化生产提供了可行方案。